Белок-белковые взаимодействия в протеомике

Август 1, 2022

Главная
Биология
Белок-белковые взаимодействия в протеомике

Содержание

3. Белковая сеть (интерактомная карта) дрожжей Узлы: белки Связи: физические взаимодействия(Связывание) P. Uetz, et al. Nature 403,
4. Биофизические методы Масс-спектрометрия Поверхностный плазмонный резонанс Флуоресцентная корреляционная спектроскопия Изотермальная калориметрия Атомно-силовая микроскопия ЯМР Рентгеноструктурный анализ
5. Характеристики ББВ Универсальны Функционирование клеток – результат белок-белковых взаимодействий Цитоскелет Рибосомы РНК полимераза Многочисленны Дрожжи: ~6.000
6. 17 Jan 2006 Связывание и локализация Облигатные олигомеры Необлигатное слабое временное Необлигатное инициируемое временное e.g. GTP•PO4-
7. Поверхностный плазмонный резонанс 1
9. Поверхностный плазмонный резонанс 2
10. Поверхностный плазмонный резонанс 3 Плазмонная кривая Интенсивность отражения как функция угла падения Θ Прерывистая линия -
11. Флуоресцентная корреляционная спектроскопия Установка для проведения автокорреляционного анализа Установка для проведения Кросс-корреляционного анализа
12. Совместная иммунопреципитация Возможно использование при условии: Наличие антител Связывание антителом индивидуального белка и белка в комплексе
13. Метод «приманки» и «обратной приманки» метод аффинной очистки в тандеме с масс-спектрометрией
14. Дрожжевая двугибридная система При образовании комплекса между исследуемыми белками объединяются ДНК-связывающий домен и фактор активации транскрипции
15. Дрожжевая двугибридная система Сшитые белки формируются в двух штаммах дрожжей, которые затем скрешиваются и высеваются на
16. Фаговый дисплей phage display В ген, кодирующий белок оболочки pIII вставляют библиотеку случайных последовательностей из 12
17. Сборка белковых фрагментов Восстановление структуры убиквитина, и отщепление репортерного белка при связывании Восстановление структуры зеленого флуоресцирующего
18. Исследование взаимодействия белков с помощью FRET
19. Зеленый флуоресцирующий белок (GFP) и FRET Наблюдение за димеризацией кальмодулина в присутствии ионов кальция Мутанты и
20. BRET Bioluminescence Resonance Energy Transfer
21. Белковые микрочипы. Для создания белковых микрочипов в качестве подложки используют различные носители, поверхность которых подвергается химической
22. Белковые наночипы. В начале XXI века были изготовлены первые белковые наночипы с использованием метода нанолитографии. С
23. Компьютерные методы Филогенетические профили Метод «Розеттского камня» Метод «соседских генов» Требуют наличия отсеквенированных геномов; Основаны на
24. Филогенетические профили Функционально-связанные белки имеют гомологов в некотором подмножестве организмов
25. Розетский камень Ряд взаимодействующих белков имеет гомологи, имеющие доменную структуру, в других организмах, в которых исходные
26. Метод «соседских генов» Если в хромосомах различных геномов, два гена-гомолога находятся рядом, существует высокая вероятность взаимодействия
28. Скачать презентацию

Слайд 2

Слайд 3

Белковая сеть (интерактомная карта) дрожжей
Узлы: белки
Связи: физические взаимодействия(Связывание)
P. Uetz,

et al. Nature 403, 623-7 (2000).

Интерактом – совокупность белок-белковых взаимодействий, характерных для данного организма

Размер интерактома коррелирует с уровнем сложности организации вида:
S. cerevisiae – 25 000
D. melanogaster – 60 000
H. sapience – 65 000

Слайд 4

Биофизические методы
Масс-спектрометрия
Поверхностный плазмонный резонанс
Флуоресцентная корреляционная спектроскопия
Изотермальная калориметрия
Атомно-силовая микроскопия
ЯМР
Рентгеноструктурный анализ
Стандартные методы
Совместная иммунопреципитация
Дрожжевая

двугибридная система
Бактериальная двугибридная система
Фаговый дисплей

Анализ белок-белковых взаимодействий

Компьютерные методы

Слайд 5

Характеристики ББВ
Универсальны
Функционирование клеток – результат белок-белковых взаимодействий
Цитоскелет
Рибосомы
РНК полимераза
Многочисленны
Дрожжи:
~6.000 белков
По крайней мере

3 взаимодействия каждый
~18.000 взаимодействий
Человек:
приблизительно ~100.000 взаимодействий
Формируют сеть:
простейшие: гомодимер(2)
обычные: гетероолигомер (более 2)
глобальные: белковые сети (все белки)

Слайд 6

17 Jan 2006
Связывание и локализация
Облигатные олигомеры
Необлигатное слабое временное
Необлигатное инициируемое временное
e.g. GTP•PO4-
Необлигатное

совместная локализация
(белки мембраны)

Необлигатное постоянное (антиген-антитело)

Сильное

Слабое

Коэкспрессируемые белки

Экспрессируемые в
различных местах

Слайд 7

Поверхностный плазмонный резонанс 1

Слайд 8

Слайд 9

Поверхностный плазмонный резонанс 2

Слайд 10

Поверхностный плазмонный резонанс 3
Плазмонная кривая
Интенсивность отражения как функция угла падения Θ
Прерывистая

линия - после адсорбции вещества.

Кинетика процесса адсорбции
Интенсивность отражения как функция времени при фиксированном угле паденияΘ.

Слайд 11

Флуоресцентная корреляционная спектроскопия
Установка для проведения
автокорреляционного анализа
Установка для проведения
Кросс-корреляционного анализа

Слайд 12

Совместная иммунопреципитация
Возможно использование при условии:
Наличие антител
Связывание антителом индивидуального белка и белка

в комплексе
Иммобилизованное антитело

Слайд 13

Метод «приманки» и «обратной приманки»
метод аффинной очистки в тандеме с масс-спектрометрией

Слайд 14

Дрожжевая двугибридная система
При образовании комплекса между исследуемыми белками объединяются ДНК-связывающий домен

и фактор активации транскрипции дрожжевого белка Gal4 – происходит экспрессия маркерного гена

Слайд 15

Дрожжевая двугибридная система
Сшитые белки формируются в двух штаммах дрожжей, которые затем

скрешиваются и высеваются на среду, для роста на которой необходима экспрессия маркерного гена.
Если формируются колонии – существует взаимодейcтвие между белками.

Слайд 16

Фаговый дисплей phage display
В ген, кодирующий белок оболочки pIII вставляют библиотеку случайных

последовательностей из 12 нуклеотидов. После заражения E. coli фагом с низкой плотностью получают библиотек фагов. Каждый фаг несет свой вариант оболочечного белка. Все пептиды
представлены частицами фага. Библиотеку спользуют для отбора фагов связывающихся с определенным субстратом.

Фаговый дисплей — это метод изучения белок-белковых, белок-пептидных и ДНК-белковых взаимодействий, который использует бактериофаги для того, чтобы cоотнести белки и генетическую информацию, кодирующую их. Для получения соответствия между генотипом и фенотипом требуется тщательный скрининг и амплификация белковых библиотек в процессе, называемом in vitro селекцией, который аналогичен естественному отбору.

Фаги
M13, T4, T7, филаментные фаги и фаг λ.

Слайд 17

Сборка белковых фрагментов
Восстановление структуры убиквитина,
и отщепление репортерного белка при связывании
Восстановление

структуры зеленого флуоресцирующего белка, и появление флуоресценции

(Protein fragment complementation assay)

Β-Галактозидаза

Β-лактамаза

Белок разделяется на два фрагмента, не функциональные в одиночку, фрагменты сшиваются с тестируемыми белками. При взаимодействии белков происходит сближение фрагментов и восстановление активности белка

Слайд 18

Исследование взаимодействия белков с помощью FRET

Слайд 19

Зеленый флуоресцирующий белок (GFP) и FRET
Наблюдение за димеризацией кальмодулина в присутствии

ионов кальция

Мутанты и гомологи GFP перекрывают практически весь видимый спектр

Возможность наблюдения in vivo

Слайд 20

BRET Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Слайд 21

Белковые микрочипы.
Для создания белковых микрочипов в качестве подложки используют различные

носители, поверхность которых подвергается химической обработке и нанесению специальных линкеров или матрикса, обеспечивающих нативно-подобное окружения для последующего внедрения в них белковых молекул. На одном микрочипе возможна фиксация от 30 до 100000 различных белков-зондов в виде микропятен. Фиксация осуществляется физическим или химическим путем. Белковые микрочипы используются для выявления различных белок-белковых взаимодействий, взаимодействий с другими молекулами. Молекулы анализируемого белка взаимодействуют с молекулой-зондом в пятнышке чипа. Несвязавшиеся белки образца вымываются раствором буфера. Молекулы образца метятся радиоактивно или люминесцентно, что позволяет регистрировать связывание целевого белка с молекулой-зондом. Нанесение в качестве зондов специфических моноклональных антител позволяет использовать подобные микрочипы в медицине для диагностики, прогнозирования и мониторинга инфекционных или каких-либо других заболеваний.

Слайд 22

Белковые наночипы.
В начале XXI века были изготовлены первые белковые наночипы

с использованием метода нанолитографии. С помощью атомно-силового микроскопа на подложку из тонкой золотой пленки наносили химический линкер, способный связывать белки в виде рисунка из точек или решеток. Свободные участки поверхности инактивировали и затем к полученному рисунку из линкера присоединяли белок. Другим методом производства белковых наночипов является использование в качестве подложки пирамидок из германия. Такой субстрат является высоко гидрофильным и таким образом пригоден для адсорбции гидрофильных белков.
Все большее развитие получает направление нанотехнологии, которое занимается разработкой упорядоченных самособирающихся белковых наноструктур. В качестве примера можно привести удачные эксперименты по созданию подобных структур на основе глюкозоксидазы. Для получения белковых наноконструкций используются в качестве соединяющих элементов так называемые «молекулярные проволоки», представляющие собой пептиды, химические соединения, углеродные нанотрубки.

Слайд 23

Компьютерные методы
Филогенетические профили
Метод «Розеттского камня»
Метод «соседских генов»
Требуют наличия отсеквенированных геномов;
Основаны на

статистических закономерностях

Слайд 24

Филогенетические профили
Функционально-связанные белки имеют гомологов в некотором подмножестве организмов

Слайд 25

Розетский камень
Ряд взаимодействующих белков имеет гомологи, имеющие доменную структуру, в других

организмах, в которых исходные белки сшиты в одну полипептидную цепь

Gyr A, Gyr B E. coli – топоизомераза II S. cerevisiae

В процессе эволюции отдельные белки могут превращаться в функциональные домены одного белка

Слайд 26

Метод «соседских генов»
Если в хромосомах различных геномов, два гена-гомолога находятся рядом,

существует высокая вероятность взаимодействия их продуктов

Предсказана функциональная связь

Геном 1

Геном 2

Геном 3

Белок-белковые взаимодействия в протеомике

Содержание

Белковая сеть (интерактомная карта) дрожжейУзлы: белки Связи: физические взаимодействия(Связывание) P. Uetz,

17 Jan 2006Связывание и локализацияОблигатные олигомерыНеоблигатное слабое временноеНеоблигатное инициируемое временноеe.g. GTP•PO4-Необлигатное

Поверхностный плазмонный резонанс 1

Поверхностный плазмонный резонанс 2

Поверхностный плазмонный резонанс 3Плазмонная криваяИнтенсивность отражения как функция угла падения ΘПрерывистая

Флуоресцентная корреляционная спектроскопияУстановка для проведенияавтокорреляционного анализаУстановка для проведенияКросс-корреляционного анализа

Совместная иммунопреципитацияВозможно использование при условии:Наличие антителСвязывание антителом индивидуального белка и белка

Метод «приманки» и «обратной приманки»метод аффинной очистки в тандеме с масс-спектрометрией

Дрожжевая двугибридная системаПри образовании комплекса между исследуемыми белками объединяются ДНК-связывающий домен

Дрожжевая двугибридная системаСшитые белки формируются в двух штаммах дрожжей, которые затем

Фаговый дисплей phage displayВ ген, кодирующий белок оболочки pIII вставляют библиотеку случайных

Сборка белковых фрагментовВосстановление структуры убиквитина, и отщепление репортерного белка при связыванииВосстановление