Болезни экспансии некодирующих повторов (синдром Мартина-Белл, атаксия Фридрейха). Методы молекулярно-генетической диагностики

Общие методы

Выделение ДНК
Полимеразная цепная реакция
Рестрикционный анализ
Электрофорез в полиакриламидном и агарозном геле
Блотинг

Оборудование для ДНК-диагностики

Амплификаторы
Термостаты настольные для пробирок (от 25-95С)
Центрифуга для микропробирок
Трансилюминатор

Источники геномной ДНК

Цельная кровь
Культура клеток
Букальный эпителий
Пятна высушенной крови
Другие источники
Сыворотка,

Электрофорез – метод разделения белков, нуклеиновых кислот по размерам фрагментов или

Горизонтальный электрофорез в агарозном геле

Фрагменты ДНК

Буфер

Агарозный гель

Чем меньше фрагменты ДНК, тем

ПЦР

Состав реакционной смеси:
Исследуемый образец
Буфер, содержащий ионы магния
Смесь АТФ, ТТФ, ГТФ,СТФ
Taq-полимераза
Специфические олигонуклеотидные

ПЦР

Стадии ПЦР
Денатурация
Отжиг
Элонгация

Денатурация

Отжиг

Полимеризация

Tag-полимераза

Специфичность ПЦР

Аллель-специфичная ПЦР

Один из праймеров коплементарен мутантному аллелю, другой- нормальному. Обратный праймер

Аллель-специфичная амплификация

Мультилокусная ПЦР

ПЦР с несколькими парами праймеров, соответствующих разным участкам гена
Пример –ДНК-диагностика

Многолокусная ПЦР с флуоресцентно меченными праймерами

ПЦР-диагностика делеций в гене дистрофина при мышечной дистрофии Дюшена.
1-маркер мол.

ПДАФ

Полиморфизм длины амплифицированных
фрагментов
регистрация небольших
делеций и дупликаций
ДНК-диагностика мутации
ΔF508

Эндонуклеазы рестрикции

Ферменты, узнающие определенные короткие (4-8 пн) последовательности в ДНК (сайты)

ПДРФ анализ

----------------CCGG-------норма режет

----------------CCGA-------мутация не режет

400 пн

300 пн

100 пн

MspI

MspI узнает
последовательность
’CCGG,

Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

ДНК- диагностика аутосомно-рецессивного заболевания

КЛАССИЧЕСКАЯ ГАЛАКТОЗЕМИЯ

Характеристика мутации
Описано более 160 различных мутаций
Мутации Q188R, K285N

ДЕТЕКЦИЯ МУТАЦИИ Q188R (исчезновение сайта рестрикции)

1. ПЦР экзонов 5-6 гена GALT

ДЕТЕКЦИЯ МУТАЦИИ К285N (появление сайта рестрикции)

1. ПЦР экзона 9 гена GALT

ДНК-диагностика

Подтверждение диагноза
Диагностика носительства
Пресимптоматическая диагностика
Пренатальная (дородовая) диагностика
Предимплантационная диагностика

Прямая ДНК-диагностика

Определение мутации, являющейся непосредственной
причиной заболевания

Косвенная ДНК-диагностика

Определение хромосомы, несущей поврежденный ген

ДНК-ДИАГНОСТИКА

ПРЯМАЯ ДНК-ДИАГНОСТИКА
Возможна только когда известна структура гена
Возможна и без больного члена

Прямая ДНК-диагностика

ПЦР ( мультиплексная ПЦР, аллель-специфическая амплификация, ПДАФ)
ПЦР-ПДРФ анализ ( анализ

Методы поиска мутаций в генах

SSCP-анализ
Денатурирующий гель электрофорез или денатурирующая ВЭЖХ

SSCP-анализ

Анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК
Замена даже одного нуклеотида приводит к измененим

Схема проведения SSCP анализа

Схема проведения анализа гетеродуплексов (НА)

Диагностика нейрофиброматоза 1 типа (определение мутаций гена NF1 методом SSCP)

1

Гибридизация ДНК-ДНК - комплементарное взаимодействие между одноцепочечными полинуклеотидами из разных источников

Прямое обнаружение мутации ΔF508 в ДНК девяти детей с CF. ДНК

FISH – флуоресцентная гибридизация in situ

Блотинг

Саузерн-блотинг
Рестрикция
Разделение изучаемого фрагмента в геле
Денатурация
Перенос на мембрану
Гибридизация с меченной пробой

Блоттинг-гибридизация

Секвенирование ДНК

Биочипы

Матрица на которую нанесены тысячи олигонуклеотидов
Олигонуклеотиды специфично гибридизуются с меченными молекулами

Косвенная ДНК-диагностика

Основана на анализе сцепления
Анализ полиморфных маркеров ДНК

1

2

3

4

1

1

2

3

3

4

Полиморфные варианты ДНК

Различия в последовательности ДНК (Однонуклеотидные полиморфизмы – SNP)
-----------AGGCTG-------------
-----------AAGCTG-------------
Различия

Вариабельность ДНК

Около 99,7% ДНК-последовательности у всех людей идентичны
Около 0,3% (примерно 10

Повторяющиеся последовательности

Сателлитная ДНК – размер повторяющегося элемента от нескольких сотен до

Анализ длин микросателлитных полиморфных повторов

Номенклатура ДНК-маркеров

ДНК-маркеры, расположенные за пределами гена обозначаются согласно их положению на

Выбор ДНК-маркеров

Внутригенные ДНК-маркеры (полиморфизмы в генах )
Расположенные близко к исследуемому гену.

Н

М

A1

A2

A3

A4

Н

A1

A3

М

A2

A4

Н

М

A1

A2

A4

A3

Расстояние оценивают в сантиморганидах (1СМ –1%- 1000 000 пн)

Чем ближе расположены

?

Пример

99 пн

96 пн

105пн

90пн

?

Пример

99 пн

96 пн

105пн

90пн

?

ДНК-диагностика

по возможности использовать несколько подходов к диагностике (например, прямые и косвенные)
анализ

Болезни экспансии тринуклеотидных повторов

Экспансия кодирующих тринуклеотидных повторов
CAG-повторы – полиглутаминовые тракты

Синдром Мартина-Белл

- Нормальное телосложение
Широкий лоб
Удлинненное лицо
Крупные оттопыренные уши

Схема расположения фолатчувствительных ломких сайтов на Х-хромосоме

Проявлением синдрома Мартина-Белл (ломкой Х-хромосомы) является экспансия тринуклеотидного повтора (CGG)n, расположенного

ДНК-диагностика синдрома Мартина-Белл

Блот-гибридизация
по Саузерну

Молекулярно-генетическая диагностика синдрома Мартина-Белл

М 1 2 3 4 5 6

Multiplex PCR methylation test for FRAXA,FRAXE and FRAXF

1 2 3 4

Метил- специфичная ПЦР

Определение количества CGG триплетов в гене FMR1,
ограничение метода - 130 повторов

М образец 1 образец 2
CpG (CGG)n СpG (CGG)n

Диагностика синдрома Мартина-Бепп

1 2 3 4 5 6 7