БТ БФ Секвенирование

sequentum — последовательность)

Расшифровка генома человека
- картирование генов
-выявление регуляторных элементов
-идентификация новых генетических маркеров
-эволюция человека и млекопитающих
-популяционные исследования
-дизайн праймеров для ДНК-диагностики

В повседневной практике научных и диагностических лабораторий
- идентификация патологических мутаций
-определение полиморфных вариантов
-построение карт метилирования генов-супрессоров
-проверка на различных этапах создания генно-инженерных конструкций, при разработке контролей для тест-систем

(нобелевская премия в 1962 г.)
1959 г. – нобелевская премия А. Корнбергу и С. Очоа за открытие механизма биосинтеза нуклеиновых кислот
1977 г. – У. Гилберт и Ф. Сэнгер опубликовали разработанные ими методы секвенирования (нобелевская премия в 1980 г.)
1978 г. – нобелевская премия В. Арберу, Г. Смиту и Д. Натансону за открытие эндонуклеаз рестрикции
1993 г. – нобелевская премия К. Мюллису за ПЦР и М. Смиту за направленный мутагенез

Сэнгером и Коулсоном
В "плюс" системе проводили четыре реакции в присутствии каждого из четырех типов нуклеотидов, а в "минус" системе - в отсутствие каждого из них. В результате, в "минус" системе терминация происходила перед dNTP данного типа, а в "плюс" системе - после него.
Полученные таким образом восемь образцов разделяли с помощью электрофореза, "считывали" сигнал и определяли последовательность исходной ДНК.

по азоту в положении 3, а гуаниновых - по азоту в положении 7. Обработка образца ДНК соляной кислотой при 0°С приводит к выщеплению метиладенина. Последующая инкубация при температуре 90°С в щелочной среде вызывает разрыв сахарно-фосфатной цепи ДНК в местах выщепления оснований. Обработка пиперидином приводит к гидролизу образца по остаткам метилгуанина. Пиримидиновые основания модифицируют гидразином. Если реакцию вести в бессолевой среде, то модифицируются как цитозин, так и тимидин; если обработку вести в присутствии 2М NaCl, то модифицируется лишь цитозин. Расщепление цепи ДНК на фрагменты и в этом случае осуществляется пиперидином. Условия реакций авторы подбирали таким образом, чтобы в итоге получить полный набор субфрагментов разной длины. Последующий электрофорез в полиакриламидном геле позволяет восстановить полную структуру исследуемого фрагмента.

копирование с помощью фрагмента Кленова ДНК полимеразы I из E.coli. В качестве праймеров использовали синтетические олигонуклеотиды. Специфическую терминацию синтеза обеспечивали добавлением в реакционную смесь помимо четырех типов dNTP (один из которых был радиоактивно мечен по альфа положению фосфата) еще и одного из 2',3'-дидезоксинуклеозидтрифосфатов (ddATP, ddTTP, ddCTP или ddGTP), который способен включаться в растущую цепь ДНК, но не способен обеспечивать дальнейшее копирование из-за отсутствия 3'-ОН группы. Отношение концентраций dNTP/ddNTP авторы подбирали экспериментально, так, чтобы в итоге получить набор копий ДНК различной длины. Таким образом, для определения первичной структуры исследуемого фрагмента ДНК требовалось провести четыре реакции копирования: по одному типу терминаторов в каждой из реакций. После этого полученные продукты разгонялись в полиакриламидном геле на соседних дорожках и по расположению полос определялась последовательность нуклеотидов.

В основе метода лежало ферментативное копирование с помощью фрагмента Кленова ДНК полимеразы I из E.coli. В качестве праймеров использовали синтетические олигонуклеотиды. Специфическую терминацию синтеза обеспечивали добавлением в реакционную смесь помимо четырех типов dNTP (один из которых был радиоактивно мечен по альфа положению фосфата) еще и одного из 2',3'-дидезоксинуклеозидтрифосфатов (ddATP, ddTTP, ddCTP или ddGTP), который способен включаться в растущую цепь ДНК, но не способен обеспечивать дальнейшее копирование из-за отсутствия 3'-ОН группы. Отношение концентраций dNTP/ddNTP авторы подбирали экспериментально, так, чтобы в итоге получить набор копий ДНК различной длины. Таким образом, для определения первичной структуры исследуемого фрагмента ДНК требовалось провести четыре реакции копирования: по одному типу терминаторов в каждой из реакций. После этого полученные продукты разгонялись в полиакриламидном геле на соседних дорожках и по расположению полос определялась последовательность нуклеотидов.

состояния в основное.
спектр эмиссии не зависит от длины волны возбуждения (он зависит от строения молекулы флуорофора и условий, в которых он находится – рН и т.п.)
длина волны испускания больше длины волны возбуждения из-за энергетических потерь (в секвенаторах Applied Biosystems возбуждающий и испускаемый свет находится в видимой части спектра 450-650 нм)
квантовый выход флуоресценции – важен для секвенирования (отношение числа испускаемых фотонов к числу поглощенных)

Первыми флуорофорами, адаптированными к нуждам секвенирования, стали соединения из семейства флуоресцеиновых (FAM, JOE) и родаминовых (TAMRA, ROX, R110, R6G) красителей. Следующее поколение флуорофоров этого семейства - dTAMRA, dROX, dR110, dR6G - получило довесок из двух остатков хлора. Это позволило несколько снизить перекрывание спектров испускания и значительно повысить интенсивность флуоресценции, а значит и чувствительность. Еще более высоким выходом флуоресценции характеризуются "трехкомпонентные" красители класса BigDye™ (Applied Biosystems), при конструировании которых был использован принцип переноса энергии. Под переносом энергии понимают явление безизлучательного переноса энергии возбужденного состояния от донора к акцептору. Донором в BigDye™ является 4'-аминометил-5(или 6)-карбоксифлуоресцеин, который связан с акцептором (представителем семейства d-родаминов) через остаток 4-аминометилбензойной кислоты.

для автоматического секвенирования ДНК

В оригинальной работе Ф. Сэнгера для проведения сиквенсовых реакций был использован Кленовский фрагмент ДНК-полимеразы I из E.Coli.
В настоящее время для секвенирования используют рекомбинантные ДНК-полимеразы, отвечающие следующим требованиям:
- отсутствие 3'- и 5'-экзонуклеазной активности,
отсутствие дискриминации по включению в растущую цепь как обычных, так и модифицированных (меченных) ddNTP.
Всего существует два разных подхода. В первом случае (сейчас практически не используется) копирование осуществляется при 37°С высокопроцессивными термолабильными полимеразами (например, T7 DNA polymerase). Однако наиболее распространен второй способ - циклический процесс, который включает денатурацию, Biosystems.

Полученные в реакции секвенирования флуоресцентно меченные одноцепочные фрагменты ДНК разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Гели, используемые в секвенировании должны позволять разделять фрагменты, отличающиеся друг от друга на один нуклеотид в широком диапазоне длин. Разделение должно проходить в денатурирующих условиях, препятствующих ренатурации и возникновению вторичных структур у разделяемых фрагментов. В общем случае этим требованиям удовлетворяют 5-8% полиакриламидные гели, содержащие 7М мочевину. В автоматическом секвенировании используют капиллярный электрофорез в линейном полиакриламиде. Капилляры представляют собой стеклянную трубку длинной 30-100 см, закатанную в полимерный пластификатор. Небольшой диаметр капилляра (50-100 мкм) позволяет проводить разделение значительно быстрее, чем в обычных гелях. Кроме того, капиллярные секвенаторы позволяют обеспечивать гораздо более высокую чувствительность за счет отсутствия горизонтальной диффузии.

от невключившихся праймеров, dNTPs и других примесей.
Проведение реакции секвенирования (наработка пула фрагментов различной длины, комплементарных матричной молекуле и заканчивающихся меченым ddNTP.)
Очистка продуктов реакции от невключившихся меченых ddNTPs и других примесей, которые могут влиять на подвижность и/или флуоресценцию полученных продуктов.
Электрофорез меченых фрагментов в денатурирующих условиях при высоком разрешении в капиллярных генетических анализаторах и автоматическая детекция флуоресцентных сигналов.
Анализ первичных данных и построение хроматограммы , идентификация мутаций или полиморфизмов.

ПЦР-продукту (например, при SSCP-анализе)

Электрофорез в агарозном геле

Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ)

Переосаждение ДНК со спиртом, растворение осадка и измерение концентрации (точно на спектрофотометре или приблизительно – по интенсивности полосы на геле)

Очистка ПЦР-продукта перед секвенированием

Неспецифические продукты амплификации

Локализация полос на геле

Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ)

Электрофорез в агарозном геле

Вырезание полосы из геля, растворение геля и выделение ДНК

Вырезание полосы из геля, эллюция ДНК и амплификация фрагмента

агарозы, 0,5х-буфер ТВЕ, 150-200 В)

1. После электрофореза вырезать в проходящем УФ полосу геля с целевым ПЦР-продуктом, затем добавить связывающий буфер в соотношении 1 мкл буфера на 1 мг геля.
2. Инкубировать пробирку при 55°С в течение, примерно, 10 мин до полного растворения геля. Если длина фрагмента < 500 п.н., то добавить изопропанол в соотношении 1/3 от исходной массы полосы геля и перемешать.
3. Нанести полученную смесь (до 800 мкл) на колонку для сорбции и центрифугировать 1 мин при 12 тыс. об./мин. Еще раз нанести 100 мкл буфера и центрифугировать. Поместить колонку в новую пробирку.
4. Добавить 700 мкл отмывочного буфера и центрифугировать 1 мин при 12 тыс. об./мин.
5. Нанести в центр колонки 50 мкл отмывочного буфера, подождать 1-2 мин и центрифугировать1 мин при 12 тыс. об./мин. Отфильтрованный раствор ДНК можно использовать для секвенирования.

ПААГ-электрофорез
(8% ПААГ – АА:бис-АА как 19:1, 1х-буфер ТВЕ, 300-400 В)

1. После завершения электрофореза и окраски геля вырезать скальпелем или иглой от шприца полосу с целевым ПЦР-продуктом.
2. Измельчить вырезанную полосу геля на дне пробирки 1,5 мл, затем добавить 0,5 мл буфера ТЕ (10 мМ Трис-HCl, 10 мМ ЭДТА, рН 8,0), перемешать на вортексе.
3. Инкубировать при 37°С в течение ночи (overnight), затем центрифугировать 5 мин при 12 тыс. об./мин. Перенести супернатант в новую пробирку, добавить 1/10 объема 3М ацетата натрия и 2 объема 96%-го этанола или 1,5 объема изопропанола, перемешать на вортексе и инкубировать 20 мин при -20°С.
4. Центрифугировать полученную смесь 15 мин при 12 тыс. об./мин. Удалить супернатант, не задевая осадка.
4. Высушить осадок, затем растворить его в 20-25 мкл деионизованной воды или ТЕ.

spin-колонках

1. Растворение LMP-агарозы

1. Вырезать полосу геля, содержащую анализируемый ПЦР-продукт, взвесить. Затем добавить буфер ТЕ, чтобы итоговая концентрация агарозы стала < 0,5%.
2. Довести полученную смесь сухим NaCl до концентрации соли 0,1М. Далее инкубировать при 65°С в течение 10 мин, несколько раз перемешивая (пока гель полностью растворится).
3. Охладить до комнатной температуры и экстрагировать фенол-хлороформным методом.
4. Добавить 10М ацетат аммония в количестве ¼ объема исходной смеси и 2-кратный объем 96%-ого этанола или 1,5-кратный объем изопропанола. Перемешать на вортексе, затем инкубировать 20 мин при -20°С.
5. Центрифугировать полученную смесь 15 мин при 12 тыс. об./мин. Удалить супернатант, не задевая осадка. Осадок сполоснуть 70%-ым этанолом, высушить.
6. Растворить осадок в деионизованной воде или буфере ТЕ.

2. Выделение ПЦР-продукта из лунки с помощью полиэтиленгликоля.

3. Эллюция ПЦР-продукта из полосы геля с помощью диализного мешка.

менее 10 нг матрицы (очищенный ПЦР-продукт до 500 п.н.), 10 мкл праймера в концентрации 3,2 пмоль/мкл, один анализ – 350 руб.
Центр коллективного пользования в ИМБ: очищенный ПЦР-продукт, праймер в количестве 3,2 пмоль на реакцию, цена одного образца – 260 руб.
«СибЭнзим»: не менее 2 мкг очищенного ПЦР-продукта, 20 пмоль праймера (для растворов определены минимальные концентрации), один анализ – 900 руб.

Постановка реакции:
К 3 мкл очищенного ПЦР-продукта добавить 3 мкл деионизованной воды, 2 мкл праймера для секвенирования (концентрация 5 пмоль/мкл) и 3 мкл BigDye™ Terminator v. 3.1 Kit.
Поместить образцы в термоциклер и запустить программу:
96°С – 1 мин
96°С – 10 с
55°С – 5 с
60°С – 4 мин

25 циклов

Охлаждение до 4°С

Праймера – 3,2 пмоль на реакцию, матрицы – в соответствии с таблицей

могут влиять на подвижность меченных фрагментов в капилляре

1. BigDye Xterminator® Purification Kit
Добавить к 10 мкл реакционной смеси 45 мкл реактива SAM, а затем 10 мкл реактива BigDye, перемешивать 30 мин при комнатной температуре.
Центрифугировать плашку 1 мин при 3 тыс. об. мин. Образцы готовы для постановки в генетический анализатор.
2. Centri-Sep™ Columns
Добавить в колонку 800 мкл деионизованной воды и оставить при комнатной температуре на 30 мин.
Центрифугировать колонку 2 мин со скоростью 3 тыс. об. мин., затем поместить колонку в новую пробирку на 1,5 мл.
Нанести на сефадекс сверху 10 мкл реакционной смеси, центрифугировать 2 мин со скоростью 3 тыс. об. мин. Отфильтрованный раствор ДНК смешать с 20 мкл HiDi-формамида (деионизованного).
3. Осаждение со спиртом
Добавить по 2 мкл 125мМ раствора ЭДТА в лунки с реакционной смесью, после того, как раствор ЭДТА достигнет дна лунок, добавить по 2 мкл 3М раствора ацетата натрия, который тоже должен достигнуть дна лунок.
Нанести в лунки по 50 мкл 100%-го этанола, перемешать, затем инкубировать при комнатной температуре 15 мин.
Центрифугировать при 4°С со скоростью 13 тыс. об. мин. в течение 30 мин.
Промыть осадок 70%-ым спиртом, подсушить.
Растворить осадок в 10 мкл деионизованной воды.

Analyzer и 3130 Genetic analyzer – 4 капилляра
3500 и 3500 Dx Genetic Analyzers – 8 капилляров
3100 и 3130xl Genetic Analyzers – 16 капилляров
3500xl и 3500xl Dx Genetic Analyzers – 24 капилляра
3730 Genetic Analyzer – 48 капилляров
3730xl Genetic Analyzer – 96 капилляров
Beckman Coulter
Seq8000 Genetic Analysis System
Amersham

эффективностью) реакция секвенирования

эффективностью) реакция секвенирования

– недостаточная очистка от ddNTPs после реакции секвенирования

Sciences", является использование эмульсионной ПЦР для одновременной параллельной подготовки сотен тысяч препаратов ДНК к секвенированию. Такая пробоподготовка состоит из следующих этапов:
ультразвуковая фрагментация (небулизация) анализируемой ДНК;
пришивка адапторов и денатурация ДНК;
получение эмульсии, содержащей в микрокаплях единичные фрагменты ДНК и полистирольные шарики с пришитым праймером;
проведение эмульсионной ПЦР (emPCR);
отмывка микрошариков от реагентов и удаление несвязянных с шариками нитей ДНК;
загрузка шариков в лунки проточной камеры;
загрузка лунок микрошариками с иммобилизованными ферментами

При пропускании реагентов через проточную ячейку регистрируются люминесцентные сигналы, излучаемые сотнями тысяч микролунок. На димерных, тримерных и тетрамерных нуклеотидных повторах интенсивность сигналов пропорционально увеличивается. Протяжённость секвенируемых участков ДНК может превышать 100 оснований

ячейке
Недостатки:
•очень короткие чтения
•длительность работы
•относительно малая доступность свободного ПО

(в $)
23 470/0.04