Генетика бактерий

Содержание

Слайд 2

ПЛАЗМИДЫ Размеры плазмид от 1 до 200 kilobase (kbp). Количество плазмид

ПЛАЗМИДЫ

Размеры плазмид от 1 до 200 kilobase (kbp).
Количество плазмид в

одной клетке от 1 до 1000 в зависимости от групп совместимости
Слайд 3

Типы плазмид Трансмиссивные Нетрансмиссивные Интегративные Неинтегративные Совместимые Несовместимые

Типы плазмид

Трансмиссивные
Нетрансмиссивные
Интегративные
Неинтегративные
Совместимые
Несовместимые

Слайд 4

Типы плазмид Трасмиссивные плазмиды обладают tra-опероном, который обеспечивает процесс конъюгации, т.е.

Типы плазмид

Трасмиссивные плазмиды обладают tra-опероном, который обеспечивает процесс конъюгации, т.е. передачу

плазмиды из одной клетки в другую
Слайд 5

Типы плазмид . Fertility-F-плазмида содержит tra-оперон. Обеспечивает процесс конъюгации Resistance-(R) фактор,содержит гены, обеспечивающие резистентность к антибиотикам.

Типы плазмид

.
Fertility-F-плазмида содержит tra-оперон. Обеспечивает процесс конъюгации
Resistance-(R) фактор,содержит гены, обеспечивающие резистентность

к антибиотикам.
Слайд 6

Типы плазмид Col-плазмида, кодирующие синтез бактерицинов, которые убивают другие бактерии. Плазмиды

Типы плазмид

Col-плазмида, кодирующие синтез бактерицинов, которые убивают другие бактерии.
Плазмиды вирулентности

– кодируют факторы агрессии у патогенных микробов
Слайд 7

Определение плазмидного профиля бактерий. Плазмидный профиль позволяет произвести внутривидовую идентификацию бактерий.

Определение плазмидного профиля бактерий.

Плазмидный профиль позволяет произвести внутривидовую идентификацию бактерий. Для

этого из бактериальной клетки выделяют плазмидную ДНК, которую разделяют электрофорезом в агарозном геле, для определения количества и размеров плазмид.
Слайд 8

Использование плазмид

Использование плазмид

Слайд 9

Подвижные генетические элементы обнаружены в составе бактериального генома, как в бактериальной

Подвижные генетические элементы обнаружены в составе бактериального генома, как в бактериальной

хромосоме, так и в плазмидах. К подвижным генетическим элементам относятся вставочные последовательности и транспозоны.
Слайд 10

подвижные генетические элементы Перемещение подвижных генетических элементов принято называть репликативной или

подвижные генетические элементы

Перемещение подвижных генетических элементов принято называть репликативной или незаконной

рекомбинацией.
В отличие от бактериальной хромосомы и плазмид подвижные генетические элементы не являются самостоятельными репликонами, так как их репликация — составной элемент репликации ДНК репликона, в составе которого они находятся.
Слайд 11

IS-элементы IS-элементы имеют размеры - 1000 н.п. и содержат лишь те

IS-элементы

IS-элементы имеют размеры - 1000 н.п. и содержат лишь те гены,

которые необходимы для их собственного перемещения — транспозиции: ген, кодирующий фермент транспозазу, обеспечивающую процесс исключения IS-элемента из ДНК и его интеграцию в новый локус, и ген, детерминирующий синтез репрессора, который регулирует весь процесс перемещения.
Слайд 12

IS-элементы Эти гены по флангам окружены инвертированными повторами, которые служат сайтами

IS-элементы

Эти гены по флангам окружены инвертированными повторами, которые служат сайтами рекомбинации,

сопровождающей перемещения вставочной последовательности при участии транспозиционных ферментов, в частности транспозаз.
Слайд 13

IS-элементы Инвертированные повторы узнает транспозаза, она делает одноцепочечные разрывы цепей ДНК,

IS-элементы

Инвертированные повторы узнает транспозаза, она делает одноцепочечные разрывы цепей ДНК, расположенных

по обе стороны от IS элемента. Оригинальная копия IS-элемента остается на прежнем месте, а ее реплицированный дубликат перемещается на новый участок.
Слайд 14

Подвижные генетические элементы Транспозоны — это сегменты ДНК, обладающие теми же

Подвижные генетические элементы

Транспозоны — это сегменты ДНК, обладающие теми же свойствами,

что и IS-элементы, но имеющие в своем составе структурные гены, например ген токсина, гены,обеспечивающие устойчивость к антибиотикам.
Слайд 15

Перемещение подвижных генетических элементов по репликону или между репликонами, вызывает: 1.

Перемещение подвижных генетических элементов по репликону или между репликонами, вызывает:

1. Инактивацию

генов тех участков ДНК, куда они, переместившись, встраиваются.
2. Образование повреждений генетического материала.
3. Слияние репликонов, т. е. встраивание плазмиды в хромосому.
4. Распространение генов в популяции бактерий, что может приводить к изменению биологических свойств популяции, смене возбудителей инфекционных заболеваний, а
также способствует эволюционным процессам среди микробов.
Слайд 16

Защита бактерий от антибиотиков осуществляется при помощи: Плазмид Транспозонов Интегронов

Защита бактерий от антибиотиков осуществляется при помощи:
Плазмид
Транспозонов
Интегронов

Слайд 17

attC1 attI attI attC2 attC1 attI attC1 attC2 5‘консервативный сегмент кассета

attC1

attI

attI

attC2

attC1

attI

attC1

attC2

5‘консервативный сегмент

кассета 1

кассета 2

Интегроны-система захвата и экспрессии генов которая состоит из

гена intI , кодирующего интегразу, рекомбинационного сайта attI и промотера.

intI

P

Слайд 18

Интеграза через посредство сайт-специфической рекомбинации включает в интегрон или вырезает из

Интеграза через посредство сайт-специфической рекомбинации включает в интегрон или вырезает из

него генные кассеты.
Мобильность генной кассеты составляет эффективную систему распространения генов резистентности к антибиотикам.
Слайд 19

Кассеты могут существовать в виде свободных циркулярных молекул ДНК, но обычно

Кассеты могут существовать в виде свободных циркулярных молекул ДНК, но обычно

они интегрированы в линейной форме в интегрон
Генная кассета экспрессируется в интегроне с общего промотера, локализованного на 5’консервативном участке интегнора.
Слайд 20

G TTRRRY ген RYYYAAC---------G TTRRRY «Инвертированный Core сайт » attC сайт


G TTRRRY ген

RYYYAAC---------G TTRRRY

«Инвертированный Core сайт »

attC сайт

« Core сайт »

Кассеты состоят

из одного гена и короткой последовательности, представляющей сайт специфической рекомбинации, который называется attC site, состоящий из 59 пар оснований « элемент 59-пар оснований »

Кассета

Слайд 21

Кассеты состоят из одного гена и короткой последовательности, представляющей сайт специфической

Кассеты состоят из одного гена и короткой последовательности, представляющей сайт специфической

рекомбинации, который называется attC site, состоящий из 59 пар оснований « элемент 59-пар оснований »
Слайд 22

Изменения генома 1. Мутации 2. Рекомбинации

Изменения генома

1. Мутации
2. Рекомбинации

Слайд 23

Слайд 24

Передача генетической информации

Передача генетической информации

Слайд 25

Конъюгация

Конъюгация

Слайд 26

F+ x F-

F+ x F-

Слайд 27

Слайд 28

Общая трансдукция

Общая трансдукция

Слайд 29

Слайд 30

Слайд 31

Схема трансфoрмации

Схема трансфoрмации

Слайд 32

Молекулярные методы используемые в микробиологии 1. ПЦР 2. Микрочип 3.Риботипирование 4.Отпечатки

Молекулярные методы используемые в микробиологии

1. ПЦР
2. Микрочип
3.Риботипирование
4.Отпечатки пальцев
5.Плазмидный профиль
6. Мультилокусное секвенирование

Идентификация

микроба без выделения чистой культуры
Внутривидовая идентификация
Слайд 33

Строение ДНК

Строение ДНК

Слайд 34

ПЦР

ПЦР

Слайд 35

амплификатор

амплификатор

Слайд 36

Риботипирование Применяется для для выявления у изучаемых штаммов различий в количестве

Риботипирование

Применяется для для выявления у изучаемых штаммов различий в количестве рибосомальных

оперонов, а также рестрикционального полиморфизма их нуклеотидных последовательностей
Слайд 37

Риботипирование 1. Исследуемую ДНК подвергают рестрикции 2. Продукты рестрикции разделяют электрофорезом

Риботипирование

1. Исследуемую ДНК подвергают рестрикции
2. Продукты рестрикции разделяют электрофорезом в полиакриламидном

геле
3. Разделенные фрагменты наносят на мембрану и обрабатывают ДНК-зондами, кодирующими 16S и 23S
РНК
Слайд 38

Риботипирование В результате гибридизации зонда с фрагментами ДНК, содержащими комплекс рРНК-оперонов

Риботипирование

В результате гибридизации зонда с фрагментами ДНК, содержащими комплекс рРНК-оперонов (в

бактериальной хромосоме имеются многочисленные опероны, содержащие гены 16Sи 23S РНК) образуется профиль, содержащий до 10 полос, обладающий видовой и штаммовой специфичностью, который исследуется автоматически.
Слайд 39

100-200 μm ДНК микрочип: Стеклянная пластика, к которой прикреплены молекулярные зонды

100-200 μm

ДНК микрочип:
Стеклянная пластика,
к которой прикреплены
молекулярные зонды

Слайд 40

Общая ДНК Специфический ПЦР продукт (i.e., 16S рРНК ген ) Меченая

Общая ДНК

Специфический ПЦР продукт
(i.e., 16S рРНК ген )

Меченая флюорохромом мишень
(ДНК или

РНК)

Олигонуклеотидный зонд
Длиной от 15 до 30 nt

Гибридизация

Микрочип с зондами

Оценка результатов

Методика

Слайд 41

Много молекул мишений Сильный сигналl Слабый сигнал Мало мишени Нет сигнала

Много молекул мишений
Сильный сигналl

Слабый сигнал
Мало мишени

Нет сигнала
Нет мишени

Стеклянная пластинка

ДНК-зонд

Меченая искомая ДНК

Прикрепленный

флюорохром

Фрагменты тотальной ДНК
(молекулы-мишени)

Принцип обнаружения специфической последовательности ДНК
при помощи микрочипа

Слайд 42

ПЦР в реальном времени ПЦР в реальном времени позволяет провести полный

ПЦР в реальном времени

ПЦР в реальном времени позволяет провести полный анализ

пробы в течение 20-60 мин и теоретически способен определить даже одну молекулу ДНК или РНК в пробе.
Слайд 43

ПЦР в реальном времени . ПЦР в реальном времени использует зонд,

ПЦР в реальном времени

. ПЦР в реальном времени использует зонд, несущий

флуорофор и тушитель, комплементарный средней части амплифицируемого фрагмента. Когда флуорофор и тушитель связаны с олигонуклеотидным зондом, наблюдается лишь незначительная флуоресцентная эмиссия.
Слайд 44

ПЦР в реальном времени Во время процесса амплификации за счет 5'-экзонуклеазной

ПЦР в реальном времени

Во время процесса амплификации за счет 5'-экзонуклеазной активности

Taq-полимеразы флуоресцентная метка переходит в раствор, освобождаясь от соседства с тушителем, и генерирует флуоресцентный сигнал, усиливающийся в реальном времени пропорционально накоплению амплификата
Слайд 45

ПЦР в реальном времени

ПЦР в реальном времени

Слайд 46

Метод branched-DNA (bDNA) амплификации В основе этого метода амплификация вирусной РНК

Метод branched-DNA (bDNA) амплификации

В основе этого метода амплификация вирусной РНК осуществляется

последовательными шагами олигонуклеотидной гибридизации.
Для этого используют серию первичных зондов и меченые ферментом вторичные зонды ДНК
Слайд 47

Метод branched-DNA (bDNA) амплификации Первичные олигонуклеотидные зонды, специфичные для РНК (или

Метод branched-DNA (bDNA) амплификации

Первичные олигонуклеотидные зонды, специфичные для РНК (или ДНК)

исследуемого образца, так называемых РНК- (ДНК) – мишений, фиксируются на твердой поверхности лунок микротитрационного планшета. Это, так называемые «зонды захвата». Исследуемый образец (РНК-мишень) разводится, и разведения добавляют в титрационные лунки.
Слайд 48

Метод branched-DNA (bDNA) амплификации Внесенные молекулы РНК(ДНК) гибридизируются с «зондами захвата».

Метод branched-DNA (bDNA) амплификации

Внесенные молекулы РНК(ДНК) гибридизируются с «зондами захвата». После

этого вносят меченые ферментом ДНК-зонды. Добавляют хемиолюминесцентный субстрат и измеряют интенсивность свечения, которая будет соответствовать количеству РНК-мишени в исследуемом образце.
Слайд 49

Метод branched-DNA (bDNA) амплификации Количественное определение вирусной РНК проводят с использованием специальных референс-стандартов.

Метод branched-DNA (bDNA) амплификации

Количественное определение вирусной РНК проводят с использованием специальных

референс-стандартов.
Слайд 50

Метод branched-DNA (bDNA) амплификации

Метод branched-DNA (bDNA) амплификации

Слайд 51

Мультилокусное секвенирование-типирование метод генетического типирования, основанный на определении последовательности нуклеотидов небольших

Мультилокусное секвенирование-типирование метод генетического типирования, основанный на определении последовательности нуклеотидов небольших фрагментов

(500н.п.) ряда генов и последующем сравнении соответствующих последовательностей у разных организмов.
Слайд 52

Мультилокусное секвенирование-типирование Чаще анализируют «гены домашнего хозяйства», которые являются необходимыми для

Мультилокусное секвенирование-типирование

Чаще анализируют «гены домашнего хозяйства», которые являются необходимыми для протекания

реакций основного метаболизма, а значит присутствуют у всех организмов. Они в силу своей исключительной важности, характеризуются низкой скоростью накопления мутаций
Слайд 53

Мультилокусное секвенирование-типирование Сравнение нуклеотидных последовательностей таких генов позволяет относительно легко устанавливать

Мультилокусное секвенирование-типирование

Сравнение нуклеотидных последовательностей таких генов позволяет относительно легко устанавливать степень

филогенетического родства между популяциями и систематизировать их. Чаще исследуют 7-8 локусов, что обеспечивает достаточную разрешающую способность метода
Слайд 54

Мультилокусное секвенирование-типирование этапы исследования 1. выделения ДНК из образца исследуемых микроорганизмов

Мультилокусное секвенирование-типирование этапы исследования

1. выделения ДНК из образца исследуемых микроорганизмов
2. амплификация участков

определенных локусом ПЦР с использованием подходящих праймеров
3. анализ амплифицированных участков с помощью секвенаторами
4. сравнение с помощью специальных программ полученные результаты с имеющимися в базе данных
Слайд 55

Плазмида рBR322

Плазмида рBR322