Инженерная энзимология. Механизмы инактивации ферментов

Механизмы инактивации ферментов
1. Изменение первичной структуры:
1.1. Разрыв полипептидной цепи:
Жесткие условия (длительное

Решение:
В литературе практически отсутствуют примеры удачной реактивации подобным образом инактивированных ферментов.

1.2.Окисление функциональных групп фермента
SH-группы цистеина и индольные фрагменты триптофана, при повышенной

Решение:
Реактивировать с помощью восстанавливающих агентов, в частности низкомолекулярных тиолов (например, цистеин

1.3. Расщепление дисульфидных связей
Вызывают : Тиолы и другие восстановленные соединений серы,

1.3. Расщепление дисульфидных связей
Щелочной гидролиз цистеина →дегидроаланин→ Благодаря нуклеофильным свойствам взаимодействует

Решение:
Добавление в среду тиолов приведет к расщеплению смешанного дисульфида и последующему

1.4. Химическая модификация каталитических SH-групп.
Катионы тяжелых металлов (Hg, Pb и

1.5. Фосфорилирование белков in vivo.
Под действием фосфорилазы и фосфатазы, содержащихся

Решение:
В литературе практически отсутствуют примеры удачной реактивации подобным образом инактивированных ферментов.

1.6. Дезаминирование остатков аспарагина.
При температурах (порядка 100 °С) и рН

Решение:
В литературе практически отсутствуют примеры удачной реактивации подобным образом инактивированных ферментов.

1.7. Радиационная инактивация ферментов
γ-облучение и УФ-свет
Воздействуют на функциональные группы ферментов, пептидные

2. Агрегация
Наблюдается при повышенной температуре, при экстремальных значениях рН, в присутствии

Решение:
Необходимо разрушить межмолекулярные ковалентные и нековалентные контакты c помощью концентрированных растворов

3. Инактивация ферментов поверхностным натяжением
Поверхностное натяжение на границе раздела между воздухом

Решение:
Добавление ПАВ снижает поверхностное натяжение до 1 дин/см.

4. Сорбция белка на стенках реакционного сосуда
Сорбция за счет нековалентных взаимодействий

Решение:
Десорбция фермента со стенок реакционного сосуда достигается за счет разрушения неспецифических

5. Диссоциация олигомерных белков на субъединицы
Вызывают: Мочевина, детергенты, кислоты или же

6. Десорбция кофактора из активного центра фермента
Вызывает: нагревание, действие хелаторов, диализ
Если

Регенерация кофакторов
Способы регенерации:
Ферментативный (методы с использованием со-
пряженных субстратов или ферментов)
Неферментативный

Ферментативный способ
Использование сопряженных субстратов.
В систему вводят избыточное количество сопряженного субстрата того

Ферментативный способ
Использование сопряженных субстратов.
Недостатка:
• используются высокие концентрации сопряженного субстрата, так как

Ферментативный способ
2. Использование сопряженных ферментативных реакций
В систему, дополнительно вводят фермент 2,

Неферментативные способы
Химические методы.
Используются дитионит натрия и некоторые соли пиридиния:
+ Низкая

Неферментативные способы
2. Электрохимические методы.
Прямое электрохимическое восстановление или
окисление.
“-” появления в процессе регенерации

СТАБИЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ В БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ

Проблемы возникающие при использовании ферментов в биотехнологических процессах:
Повышенные температуры
Экстремальные значения pH

Основные подходы для стабилизации ферментов :
Добавление стабилизирующих веществ в среду, в

Стабилизация ферментов с помощью:
Субстратов или их аналогов:
Фермент-субстратный комплекс часто

Стабилизация ферментов с помощью:
2. Органических растворителей:
Многоатомные спирты стабилизируют некоторые ферменты

Стабилизация ферментов с помощью:
3. Солей:
При низких концентрациях солей (<0,1M) катионы Са2+,

Химическая модификация фермента
1. Фермент принимает более стабильную конформацию.
2. Введение в белок

Иммобилизация фермента позволяет:
Повысить устойчивость фермента (нагреванию, автолизу, действию агрессивных сред и

Иммобилизованные ферменты – это препараты ферментов, молекулы которых связаны с носителем,

Методы иммобилизации:
В качестве носителей могут применяться:
1)Органические материалы:
1.1) природные (полисахариды, белки, липиды)

Методы физической иммобилизации:
1) адсорбция фермента на нерастворимом носителе в результате электростатических,

Методы физической иммобилизации:
1)адсорбция фермента на нерастворимом носителе
Достигается путем контакта водного раствора

Методы физической иммобилизации:
1)адсорбция фермента на нерастворимом носителе
Факторы влияющие на адсорбцию:
Удельная поверхность

Методы физической иммобилизации:
1)адсорбция фермента на нерастворимом носителе
Преимущества:
Относительная простота методики
Доступность носителей
Недостатки:
Недостаточная прочность

Методы физической иммобилизации:
2) включение фермента в полупроницаемую капсулу, в полупроницаемую мембрану

Методы физической иммобилизации:
2) включение фермента в полупроницаемую капсулу, в полупроницаемую мембрану
Преимущества:
Относительная

Методы физической иммобилизации:
3) механическое включение фермента в гелевые структуры
Фермент включается в

Методы физической иммобилизации:
3) механическое включение фермента в гелевые структуры
Необходимо учитывать:
Соответствие размера

Методы физической иммобилизации:
3) механическое включение фермента в гелевые структуры
Преимущества:
Относительная простота методики
Повышенная

Методы физической иммобилизации:
4) Включение в двухфазную систему
Фермент растворим только в одной

Методы химической иммобилизации:
Образовании ковалентных связей между ферментом и носителем.
Преимущества:
1) Высокая прочность

При иммобилизации ферментов необходимо соблюдать следующие условия:
1. Активные группы матрицы не

Термозимы
Стабильны в условиях высокой температуры, высоких концентраций солей и экстремальных значений

Механизмы ответственны за термоустойчивость ферментов у термозимов:
Между мезофильными и термофильными версиями

Было обнаружено, что дегидрогеназа из Pyrococcus furiosus (Tm == 105 °C)

Возросшая термостабильность коррелирует:
с увеличением жесткости белковой структуры за счет уменьшения содержания

Механизмы стабилизации:
• минимизация доступной площади гидрофобной поверхности белка;
• оптимизация упаковки атомов

Применение ферментов из экстремофилов
Современные технологии молекулярной биологии и генной инженерии позволяет:
1)

Применение ферментов из экстремофилов:
Крахмал используется для производства сахаров. Сначала процесс ведется

Применение ферментов из экстремофилов:
Наиболее термостабильные α-амилазы были обнаружены у archaea Pyrococcus

Применение ферментов из экстремофилов:
Протеолитические ферменты
Сериновые щелочные протеиназы широко используются в качестве

Применение ферментов из экстремофилов:
ДНК-полимеразы
Термостабильные ДНК-полимеразы используются в ПЦР и играют важную