Методы исследования уровня экспрессии генов

Июль 27, 2022

Главная
Биология
Методы исследования уровня экспрессии генов

Содержание

2. Представленность различных мРНК 95 %
3. Разделение РНК в денатурирующем геле по размеру Перенос РНК на нитроцеллюлозный фильтр Отмывка от несвязавшегося зонда
4. Нозерн-блот анализ (Nothern-blot) Преимущества метода Недостатки метода Довольно точная оценка экспрессии гена Сравнительный анализ нескольких образцов
5. Методы на основе ПЦР Количественный: ПЦР в реальном времени (Real-time PCR) Цифровая ПЦР Качественные: Дифференциальный дисплей
6. Обратная транскриптаза Реакция обратной транскрипции – синтез кДНК по матрице мРНК поли A хвост 3’ мРНК
7. Полимеразная цепная реакция
8. Полимеразная цепная реакция Наработка специфического продукта. Теоретицеский коэффициент размножения – 2 Реальный коэффициент размножения в хорошо
9. Дифференциальный дисплей
10. Дифференциальный дисплей Преимущества метода Проведение сравнительного анализа Анализ экспрессии сразу большого количества генов Теоретически возможно идентифицировать
11. относительный уровень экспрессии гена Неконкурентная мультиплексная ПЦР является методом относительной оценки экспрессии генов. Используют две пары
12. Конкурентная мультиплексная ПЦР Оба продукта ПЦР синтезируются с ОДНИХ и тех же праймеров. Конкурентная ДНК добавляется
13. Особенности ПЦР, искажающие количественные показатели Существование фазы «плато» Уровень плато определяется множеством параметров Высокая чувствительность метода
14. Мультиплексная ПЦР Преимущества метода Недостатки метода Довольно точная оценка экспрессии гена (возможно обнаружить двукратные различия при
15. Real-time PCR с использованием Taq-Man зондов.
16. ПЦР в реальном времени (Real-time PCR) Детекция продукта производится в режиме реального времени по флуоресценции возбуждаемого
17. Преимущества метода Real-time PCR с использованием Taq-Man зондов. Точный метод оценки уровня экспрессии гена Возможен сравнительный
18. Digital PCR. Недостатки метода Сложности с выбором зондов Цена Комбинация ПЦР в реальном времени с Taqman-зондами
19. Скрининг изменений экспрессии с помощью микрочипов Микрочипы – стеклянные пластинки с иммобилизоваными короткими фрагментами ДНК Олигонуклеотидные
20. Скрининг изменений экспрессии с помощью микрочипов
21. Скрининг изменений экспрессии с помощью микрочипов
22. Скрининг изменений экспрессии с помощью микрочипов Преимущества метода Быстрый скрининг по большому количеству генов Наличие уже
23. SAGE - serial analysis of gene expression Синтез кДНК Выделение фракции поли-А РНК Разрезание первой рестриктазой
24. SAGE - serial analysis of gene expression Более точное количественное измерение уровней транскрипции по сравнению с
25. Прямое измерение уровня экспрессии с помощью методов высокопроизводительного секвенирования (RNA-Seq) Фрагментация РНК РНКазой III Лигирование со
26. Прямое измерение уровня экспрессии с помощью методов высокопроизводительного секвенирования Проведение ПЦР в эмульсии Собственно секвенирование Выравнивание
27. Single cell transcriptome
28. Freed 2008 Метод, свободный от начальной гипотезы Быстрый и сравнительно недорогой скрининг транскриптома без предварительных его
29. Объёмы данных для различных вариантов RNA-Seq Ribo-depletion – удаление рибосомальных РНК в ходе пробоподготовки. Стандартный вариант
30. Внутренний контроль – ERCC spike-In Неравномерность распределения чтений по гену Пределы достоверности
31. Относительная обеднённость/обогащённость определёнными последовательностями в библиотеках Неравномерность представленности фрагментов по длине транскрипта Прямое измерение уровня экспрессии
33. Скачать презентацию

Слайд 2

Представленность различных мРНК
95 %

Слайд 3

Разделение РНК в денатурирующем геле по размеру
Перенос РНК на нитроцеллюлозный фильтр

Отмывка от несвязавшегося зонда

Результат авторадиографии

Гибридизация с радиоактивно меченым зондом

Нозерн-блот анализ (Nothern-blot)

Слайд 4

Нозерн-блот анализ (Nothern-blot)
Преимущества метода
Недостатки метода
Довольно точная оценка экспрессии гена
Сравнительный анализ нескольких

образцов
Возможность оценить не только наличие, но и размер транскрипта (транскриптов)

Недостаточная чувствительность метода
Необходимы довольно большие количества суммарной РНК
Необходимость работать с радиоактивными изотопами.
Редкие и слабо представленные РНК не выявляются, что может приводить к ложноотрицательному результату.

Слайд 5

Методы на основе ПЦР
Количественный:
ПЦР в реальном времени (Real-time PCR)
Цифровая ПЦР
Качественные:
Дифференциальный дисплей
Неконкурентная

мультиплексная ПЦР

Полуколичественные:
Конкурентная мультиплексная ПЦР
Анализ с помощью микрочипов

Слайд 6

Обратная транскриптаза
Реакция обратной транскрипции – синтез кДНК по матрице

мРНК

поли A хвост

3’

мРНК

oligo dT праймер

кДНК

Реакция обратной транскрипции

Слайд 7

Полимеразная цепная реакция

Слайд 8

Полимеразная цепная реакция
Наработка специфического продукта.
Теоретицеский коэффициент размножения – 2
Реальный коэффициент размножения

в хорошо
оптимизированных условиях– 1,6-1,4.

Слайд 9

Дифференциальный дисплей

Слайд 10

Дифференциальный дисплей
Преимущества метода
Проведение сравнительного анализа
Анализ экспрессии сразу большого количества генов

Теоретически возможно идентифицировать все неизвестные транскрипты
Низкая стоимость используемых реактивов

Недостатки метода
Получение качественных, а не количественных данных
Большая трудоёмкость метода
За счет конкуренции за dNTP и фермент не выявляются “редкие” малокопийные мРНК

Слайд 11

относительный уровень экспрессии гена
Неконкурентная мультиплексная ПЦР является методом относительной оценки

экспрессии генов. Используют две пары специфических праймеров в одной реакции. В качестве контроля выступают гены, экспрессия которых слабо меняется в условиях эксперимента.

Интенсивность полосы А

Интенсивность контрольной
полосы

Неконкурентная мультиплексная ПЦР

Слайд 12

Конкурентная мультиплексная ПЦР
Оба продукта ПЦР синтезируются с ОДНИХ и тех же

праймеров.
Конкурентная ДНК добавляется в реакции серией
заранее известных разведений

Слайд 13

Особенности ПЦР, искажающие количественные показатели
Существование фазы «плато»
Уровень плато определяется множеством параметров
Высокая

чувствительность метода
Чувствительность ферментов к загрязнениям и изменению условий

Низкая чувствительность метода детекции (окраска бромистым этидием).
Для фрагментов длиной менее 300 п.н. детектируемые количества продукта нарабатываются уже в районе перегиба, а не в линейной фазе реакции

Различия в эффективности амплификации фрагментов разной длины и разного нуклеотидного состава.
При разнице эффективности амплификации
двух фрагментов 5% изменение относительных концентраций уже на 25 цикле составит 3,6 раза.
При 10% - 14 раз
При 15% - 58 раз.

Слайд 14

Мультиплексная ПЦР
Преимущества метода
Недостатки метода
Довольно точная оценка экспрессии гена (возможно обнаружить двукратные

различия при статистической обработке результатов)
Метод достаточно дёшев, прост и быстр.
Возможно оценить экспрессию редких и слабо представленных мРНК
Требуется малое количество исходного материала

Главный недостаток – сильная подверженность влиянию «синдрома китайского студента».
Точность метода сильно зависит от квалификации и подготовки исследователя, что не является объективным критерием.
На точности метода сильно сказываются недостаточно чувствительные методы детекции

Слайд 15

Real-time PCR с использованием Taq-Man зондов.

Слайд 16

ПЦР в реальном времени (Real-time PCR)
Детекция продукта производится в режиме реального

времени по флуоресценции возбуждаемого лазером красителя непосредственно в реакционной смеси.

Упрощённая модификация метода – использование интеркалирующего красителя SYBR-green.

Образование целевого продукта отслеживается при построении кривой плавления. Высокая чувствительность метода позволяет гарантированно снимать показания на линейной части кривой, до выхода реакции на плато.

Слайд 17

Преимущества метода
Real-time PCR с использованием Taq-Man зондов.
Точный метод оценки уровня экспрессии

гена
Возможен сравнительный анализ экспрессии нескольких (до 4) генов в одной пробе при использовании разных флуоресцентных красителей
Быстрота получения результата.

Недостатки метода
Сложности с выбором зондов
Высокие трудозатраты и цена

Слайд 18

Digital PCR.
Недостатки метода
Сложности с выбором зондов
Цена
Комбинация ПЦР в реальном времени

с Taqman-зондами
и эмульсионной ПЦР с одной молекулы

Преимущества метода
Самый точный
Очень чувствительный

Слайд 19

Скрининг изменений экспрессии с помощью микрочипов
Микрочипы – стеклянные пластинки с иммобилизоваными

короткими фрагментами ДНК
Олигонуклеотидные
На основе участков кДНК

Слайд 20

Скрининг изменений экспрессии с помощью микрочипов

Слайд 21

Скрининг изменений экспрессии с помощью микрочипов

Слайд 22

Скрининг изменений экспрессии с помощью микрочипов
Преимущества метода
Быстрый скрининг по большому количеству

генов
Наличие уже готовых панелей с различными целевыми наборами зондов.
Возможность автоматизации процедуры

Недостатки метода

Слабая воспроизводимость
Высокие уровни ошибок пере- и недопредсказания
Результаты необходимо перепроверять методом Real-time PCR
Исследуются только заказанные транскрипты

Слайд 23

SAGE - serial analysis of gene expression
Синтез кДНК
Выделение фракции поли-А

РНК
Разрезание первой рестриктазой
Лигирование с линкером, содержащим сайт Eco15I
Рестрикция ферментом Eco15I
Лигирование с образованием ди-тагов
Отрезание линкеров третьей рестриктазой
Лигирование в конкатемеры
Клонирование в бактериальный вектор
Секвенирование методом Сэнгера
Секвенирование на пиросеквенаторе Roche

Модификации метода – различаются по длине тага.
SAGE, LongSAGE, SuperSAGE

Слайд 24

SAGE - serial analysis of gene expression
Более точное количественное измерение

уровней транскрипции по сравнению с микрочиповыми технологиями
Возможность получения данных о неизвестных до того транскриптах
Недостатки:
Меньшая точность по сравнению с Real-Time PCR
Большая стоимость и трудоёмкость по сравнению с микрочипами

Достоинства SAGE

Слайд 25

Прямое измерение уровня экспрессии с помощью методов
высокопроизводительного секвенирования (RNA-Seq)
Фрагментация РНК

РНКазой III
Лигирование со специфическими адаптерами
Получение кДНК
Фракционирование
Амплификация библиотеки

Добавление внутренних контролей ERCC mix
Получение фракции мРНК и ribo-depleted RNA

Слайд 26

Прямое измерение уровня экспрессии с помощью методов
высокопроизводительного секвенирования
Проведение ПЦР в

эмульсии
Собственно секвенирование
Выравнивание и подсчёт копийности

Слайд 27

Single cell transcriptome

Слайд 28

Freed 2008
Метод, свободный от начальной гипотезы
Быстрый и сравнительно недорогой скрининг транскриптома

без предварительных его исследований.
Возможность прямого сравнения экспрессии интересующих групп генов.
Идентификация групп генов, скоординированно меняющих свою экспрессию.
Наглядная классификация транскриптов по функциям и группам.
Обнаружение кластеров скоординированно меняющих экспрессию генов, не связанных общей функцией

Прямое измерение уровня экспрессии с помощью методов
высокопроизводительного секвенирования

Слайд 29

Объёмы данных для различных вариантов RNA-Seq
Ribo-depletion – удаление рибосомальных РНК в

ходе пробоподготовки. Стандартный вариант – чтение с одного праймера, 50-75 п.н. – 40 млн. ридов. Позволяет идентифицировать экспрессию 80-85% генов При изучении альтернативного сплайсинга \ транскрипции – чтение с двух сторон по 75\150 п.н.
Поли-А РНК - чтение с одного праймера, 50-75 п.н. – 20 млн. ридов.
Транскриптом de novo – максимально длинные чтения, поли-А РНК, направленные библиотеки, 20-40 млн. ридов
Анализ микроРНК – 5-10 млн. ридов, чтение 36 п.н.
Single cell RNA-Seq – от 1 млн. ридов в стандартной методике до 100 тыс. ридов в модификациях.

Слайд 30

Внутренний контроль – ERCC spike-In
Неравномерность распределения чтений по гену
Пределы достоверности

Слайд 31

Относительная обеднённость/обогащённость определёнными последовательностями
в библиотеках
Неравномерность представленности фрагментов по длине транскрипта
Прямое

измерение уровня экспрессии с помощью методов
высокопроизводительного секвенирования

Методы исследования уровня экспрессии генов

Содержание

Представленность различных мРНК95 %

Разделение РНК в денатурирующем геле по размеруПеренос РНК на нитроцеллюлозный фильтр

Нозерн-блот анализ (Nothern-blot)Преимущества методаНедостатки методаДовольно точная оценка экспрессии генаСравнительный анализ нескольких

Методы на основе ПЦРКоличественный:ПЦР в реальном времени (Real-time PCR)Цифровая ПЦРКачественные:Дифференциальный дисплейНеконкурентная

Обратная транскриптаза Реакция обратной транскрипции – синтез кДНК по матрице

Полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакцияНаработка специфического продукта.Теоретицеский коэффициент размножения – 2Реальный коэффициент размножения

Дифференциальный дисплей

Дифференциальный дисплей Преимущества методаПроведение сравнительного анализаАнализ экспрессии сразу большого количества генов

относительный уровень экспрессии генаНеконкурентная мультиплексная ПЦР является методом относительной оценки

Конкурентная мультиплексная ПЦРОба продукта ПЦР синтезируются с ОДНИХ и тех же

Особенности ПЦР, искажающие количественные показателиСуществование фазы «плато»Уровень плато определяется множеством параметровВысокая

Мультиплексная ПЦРПреимущества методаНедостатки методаДовольно точная оценка экспрессии гена (возможно обнаружить двукратные

Real-time PCR с использованием Taq-Man зондов.

ПЦР в реальном времени (Real-time PCR)Детекция продукта производится в режиме реального

Преимущества методаReal-time PCR с использованием Taq-Man зондов.Точный метод оценки уровня экспрессии

Digital PCR. Недостатки методаСложности с выбором зондовЦенаКомбинация ПЦР в реальном времени

Скрининг изменений экспрессии с помощью микрочиповМикрочипы – стеклянные пластинки с иммобилизоваными

Скрининг изменений экспрессии с помощью микрочипов

Скрининг изменений экспрессии с помощью микрочипов

Скрининг изменений экспрессии с помощью микрочиповПреимущества методаБыстрый скрининг по большому количеству

SAGE - serial analysis of gene expression Синтез кДНКВыделение фракции поли-А

SAGE - serial analysis of gene expression Более точное количественное измерение

Прямое измерение уровня экспрессии с помощью методов высокопроизводительного секвенирования (RNA-Seq)Фрагментация РНК

Прямое измерение уровня экспрессии с помощью методов высокопроизводительного секвенированияПроведение ПЦР в

Single cell transcriptome

Freed 2008Метод, свободный от начальной гипотезыБыстрый и сравнительно недорогой скрининг транскриптома

Объёмы данных для различных вариантов RNA-SeqRibo-depletion – удаление рибосомальных РНК в

Внутренний контроль – ERCC spike-InНеравномерность распределения чтений по генуПределы достоверности

Похожие презентации

Представленность различных мРНК
95 %

Разделение РНК в денатурирующем геле по размеру
Перенос РНК на нитроцеллюлозный фильтр

Нозерн-блот анализ (Nothern-blot)
Преимущества метода
Недостатки метода
Довольно точная оценка экспрессии гена
Сравнительный анализ нескольких

Методы на основе ПЦР
Количественный:
ПЦР в реальном времени (Real-time PCR)
Цифровая ПЦР
Качественные:
Дифференциальный дисплей
Неконкурентная

Обратная транскриптаза
Реакция обратной транскрипции – синтез кДНК по матрице

Полимеразная цепная реакция
Наработка специфического продукта.
Теоретицеский коэффициент размножения – 2
Реальный коэффициент размножения

Дифференциальный дисплей
Преимущества метода
Проведение сравнительного анализа
Анализ экспрессии сразу большого количества генов

относительный уровень экспрессии гена
Неконкурентная мультиплексная ПЦР является методом относительной оценки

Конкурентная мультиплексная ПЦР
Оба продукта ПЦР синтезируются с ОДНИХ и тех же

Особенности ПЦР, искажающие количественные показатели
Существование фазы «плато»
Уровень плато определяется множеством параметров
Высокая

Мультиплексная ПЦР
Преимущества метода
Недостатки метода
Довольно точная оценка экспрессии гена (возможно обнаружить двукратные

ПЦР в реальном времени (Real-time PCR)
Детекция продукта производится в режиме реального

Преимущества метода
Real-time PCR с использованием Taq-Man зондов.
Точный метод оценки уровня экспрессии

Digital PCR.
Недостатки метода
Сложности с выбором зондов
Цена
Комбинация ПЦР в реальном времени

Скрининг изменений экспрессии с помощью микрочипов
Микрочипы – стеклянные пластинки с иммобилизоваными

Скрининг изменений экспрессии с помощью микрочипов
Преимущества метода
Быстрый скрининг по большому количеству

SAGE - serial analysis of gene expression
Синтез кДНК
Выделение фракции поли-А

SAGE - serial analysis of gene expression
Более точное количественное измерение

Прямое измерение уровня экспрессии с помощью методов
высокопроизводительного секвенирования (RNA-Seq)
Фрагментация РНК

Прямое измерение уровня экспрессии с помощью методов
высокопроизводительного секвенирования
Проведение ПЦР в

Freed 2008
Метод, свободный от начальной гипотезы
Быстрый и сравнительно недорогой скрининг транскриптома

Объёмы данных для различных вариантов RNA-Seq
Ribo-depletion – удаление рибосомальных РНК в

Внутренний контроль – ERCC spike-In
Неравномерность распределения чтений по гену
Пределы достоверности