Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и методы, основанные на ПЦР

Июль 25, 2022

Главная
Биология
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и методы, основанные на ПЦР

Содержание

2. Введение в ПЦР и методы основанные на ПЦР: микросателиты (STR), AFLP, RAPD, PCR-RFLP, Inter-SINE PCR и
3. История ПЦР Первоначально искусственный синтез ДНК с использованием олигонуклеотидов был предложен в 1971 (!) г. но
4. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) Выделенная ДНК Буфер Mg dNTPs (dA, dC, dT, dG) Taq-полимераза Праймеры («туда
5. Схема ПЦР
6. Ролик про ПЦР с диска
7. Эволюция ПЦР. Возможно, «самый первый»
8. Эволюция ПЦР. Амплификатор Терцик
9. Эволюция ПЦР. Амплификатор “Tetrad Thermal Cycler” (MJ Research PTC-225, USA)
10. Термостойкая ДНК-полимераза Taq-полимераза - Thermus aquaticus Pfu-полимераза - Pyrococcus furiosus Pwo-полимераза- Pyrococcus woesei И др. А
11. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) наборы реактивов для ПЦР «Сухие ядра Гаджи Омаровича» (ИОГЕН, БИОКОМ) - «…просто
12. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) наборы реактивов для ПЦР Наборы для ПЦР Силекс (www.sileks.com), Хеликон (www.helicon.ru) и
13. Оптимизация ПЦР Подбор температуры отжига Титрование по магнию (1.0 – 3.5 mM) Если не помогло: Touch-Down
14. Strictly following the protocol in original publication Grooijmans et. al. 1997 mfw1 mfw4 mfw7 mfw9 mfw16
15. ПЦР: правила «хорошего тона» Всегда ставить отрицательный контроль (вода вместо ДНК) Ставить положительный контроль (с заведомо
16. Вещества, улучшающие специфичность (и/или) выход PCR реакции
17. Влияние на ПЦР реакцию:
18. Влияние красителей на PCR. Красители: Cresol red 0.2mM Бромфеноловый синий EtBr~ 0.1µg/ml Вывод – краситель и
19. Праймеры для ПЦР Длина 18-30 пар оснований GC-состав ~ 40—60 %; близкие Tm праймеров (отличия не
20. Праймеры для ПЦР «Универсальные» Баркодинг: СOI (Folmer et al., 1994 HCO2198 TAA ACT TCA GGG TGA
21. Праймеры для ПЦР Создание своих праймеров Программы: PrimerSelect (DNASTAR), Oligo Необходимо знать последовательность (генбанк) Размер фрагмента
23. Разработка праймеров – температура отжига
24. Разработка праймеров – шпильки и димеры
25. Разработка праймеров – ложные сайты отжига
26. Создание праймеров на фланкирующие области в программе PrimerSelect (DNAStar).
27. Nested PCR (гнездовой ПЦР)
28. Touch-Down PCR Уменьшение температуры отжига на каждом цикле Удлинение времени отжига на каждом цикле Иногда –
29. Hot-Start PCR Добавление полимеразы после предварительного прогрева Или: активация инактивированной белками полимеразы предварительным длительным прогревом (10-15
31. Скачать презентацию

Слайд 2

Введение в ПЦР и методы основанные на ПЦР: микросателиты (STR),
AFLP,

RAPD,
PCR-RFLP,
Inter-SINE PCR и т.п.
Правила написания праймеров. Интерпретация данных «фрагментного анализа». Использование ДНК-маркеров в популяционной генетике, сравнение возможностей микросателлитного и изофермнентного анализа.

Слайд 3

История ПЦР
Первоначально искусственный синтез ДНК с использованием олигонуклеотидов был предложен в

1971 (!) г. но не нашел применения (Kleppe et al., 1971)
Предложен в 1983 г Кэрри Маллисом (Kary Mullis, (публикация 1985г).
Нобелевская премия по химии 1993 г.
Патент Cetus Corporation, затем продан за 300000 Hoffmann-La Roche. Значительно тормозил развитие методов, основанных на ПЦР, неоднократно оспаривался в судах (Du Pont, Promega)
Патент истек в 2005 г.!

Слайд 4

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Выделенная ДНК
Буфер
Mg
dNTPs (dA, dC, dT, dG)
Taq-полимераза
Праймеры («туда и

обратно»)
Амплификатор
Набор на 100 реакций – от 900 до 2000 руб

Слайд 5

Схема ПЦР

Слайд 6

Ролик про ПЦР с диска

Слайд 7

Эволюция ПЦР. Возможно, «самый первый»

Слайд 8

Эволюция ПЦР. Амплификатор Терцик

Слайд 9

Эволюция ПЦР. Амплификатор “Tetrad Thermal Cycler” (MJ Research PTC-225, USA)

Слайд 10

Термостойкая ДНК-полимераза
Taq-полимераза - Thermus aquaticus
Pfu-полимераза - Pyrococcus furiosus
Pwo-полимераза- Pyrococcus woesei
И

др.
А также смеси в различных сочетаниях

Слайд 11

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) наборы реактивов для ПЦР
«Сухие ядра Гаджи Омаровича» (ИОГЕН,

БИОКОМ) - «…просто добавь воды»
- готовый сухой премикс в разовых пробирках
- дилюэнт (разбавитель)
- праймеры
- ДНК Вашего организма
Плюсы: работает как зверь, не безумно дорого (15р реакция), не требует (?) морозильника.
Минусы: нет возможности оптимизации по Mg, объему и т.п.

Слайд 12

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) наборы реактивов для ПЦР
Наборы для ПЦР
Силекс (www.sileks.com), Хеликон

(www.helicon.ru) и много других
Есть возможность оптимизации,
HotStart и другие модификации фермента

Слайд 13

Оптимизация ПЦР
Подбор температуры отжига
Титрование по магнию (1.0 – 3.5 mM)
Если не

помогло:
Touch-Down PCR с широким диапазоном t
Удлинение отжига и синтеза (до 2 минут)
Работа с матрицей и с методом экстракции ДНК (переосаждение (доп. очистка), концентрация, разбавление, вырезание из агарозы крупных фрагментов и т.д.)
Использование других праймеров
Nested PCR

Слайд 14

Strictly following the protocol in original publication Grooijmans et. al. 1997

mfw1

mfw4

mfw7

mfw9

mfw16

mfw28

mfw31

mfw 1

mfw4

mfw7

mfw9

mfw16

mfw31

Adjusted:
Touchdown
Annealing to
Mg2+
etc.

Оптимизация ПЦР – титрование по Mg. и температуре отжига

Слайд 15

ПЦР: правила «хорошего тона»
Всегда ставить отрицательный контроль (вода вместо ДНК)
Ставить положительный

контроль (с заведомо работающей ДНК)
ПЦР-гигиена - не допускать попадания ПЦР-продукта в зону, где Вы собираете реакцию
Иметь «свой» набор реактивов и праймеров, пипетки должны быть четко маркированы (до и после ПЦР разные комплекты)
ПЦР продукты хранятся в отдельном холодильнике, и берутся другим комплектом рук.

Слайд 16

Вещества, улучшающие специфичность (и/или) выход PCR реакции

Слайд 17

Влияние на ПЦР реакцию:

Слайд 18

Влияние красителей на PCR.
Красители:
Cresol red 0.2mM
Бромфеноловый синий <20µg/ml
EtBr~

0.1µg/ml
Вывод – краситель и утяжелитель (глицерин, сахароза) можно добавлять непосредственно в ПЦР реакцию (обле

Слайд 19

Праймеры для ПЦР
Длина 18-30 пар оснований
GC-состав ~ 40—60 %;
близкие Tm праймеров (отличия

не более, чем на 5 °C);
Температура отжига более 55С и менее 60С (если возможно)
отсутствие неспецифических вторичных структур — шпилек и димеров;
желательно, чтобы на 3’-конце был гуанин или цитозин, поскольку они образуют три водородные связи с молекулой матрицы, делая гибридизацию более стабильной.
Если используем ранее опубликованные праймеры:
Внимательно читать раздел методы !
Не верить условиям ПЦР в разделе «методы» (требуется оптимизация под Ваши реактивы и оборудование)

Слайд 20

Праймеры для ПЦР
«Универсальные»
Баркодинг: СOI (Folmer et al., 1994
HCO2198 TAA ACT TCA GGG

TGA CCA AAA AAT CA
LCO1490 GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG
Simon 1991, 1994 – universal primers for arthropods

Слайд 21

Праймеры для ПЦР
Создание своих праймеров
Программы: PrimerSelect (DNASTAR), Oligo
Необходимо знать последовательность (генбанк)
Размер

фрагмента
Проверка на димеры и шпильки
Проверка на ложные сайты отжига

Слайд 22

Слайд 23

Разработка праймеров – температура отжига

Слайд 24

Разработка праймеров – шпильки и димеры

Слайд 25

Разработка праймеров – ложные сайты отжига

Слайд 26

Создание праймеров на фланкирующие области в программе PrimerSelect (DNAStar).

Слайд 27

Nested PCR (гнездовой ПЦР)

Слайд 28

Touch-Down PCR
Уменьшение температуры отжига на каждом цикле
Удлинение времени отжига на каждом

цикле
Иногда – уменьшение также и температуры синтеза на каждом цикле

Слайд 29

Hot-Start PCR
Добавление полимеразы после предварительного прогрева
Или: активация инактивированной белками полимеразы предварительным

длительным прогревом (10-15 минут)
Или: использование плавких разделителей между полимеразой и матрицей
Позволяет избежать удлинения неспецифически севших праймеров, повышает специфичность реакции

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и методы, основанные на ПЦР

Содержание

Введение в ПЦР и методы основанные на ПЦР: микросателиты (STR), AFLP,

История ПЦРПервоначально искусственный синтез ДНК с использованием олигонуклеотидов был предложен в

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)Выделенная ДНКБуферMgdNTPs (dA, dC, dT, dG)Taq-полимеразаПраймеры («туда и

Схема ПЦР

Ролик про ПЦР с диска

Эволюция ПЦР. Возможно, «самый первый»

Эволюция ПЦР. Амплификатор Терцик

Эволюция ПЦР. Амплификатор “Tetrad Thermal Cycler” (MJ Research PTC-225, USA)

Термостойкая ДНК-полимеразаTaq-полимераза - Thermus aquaticus Pfu-полимераза - Pyrococcus furiosusPwo-полимераза- Pyrococcus woeseiИ

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) наборы реактивов для ПЦР«Сухие ядра Гаджи Омаровича» (ИОГЕН,

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) наборы реактивов для ПЦРНаборы для ПЦРСилекс (www.sileks.com), Хеликон

Оптимизация ПЦРПодбор температуры отжигаТитрование по магнию (1.0 – 3.5 mM)Если не