Массспектрометрическое (МС) секвенирование белков

Июль 24, 2022

Главная
Физика
Массспектрометрическое (МС) секвенирование белков

Содержание

2. Масс-спектрометрия Это анализ ионизированных молекул исследуемого вещества (и/или ионов фрагментов молекул) по отношению массы к заряду
3. Схема масс-спектрометра и этапы анализа 1. Дозатор проб (инжектор) вводит пробу в масс-спектрометр 2. Ионизатор проб
4. Классификация методов масс-спектрометрии Для любого метода масс-спектрометрии важны два момента: Способ ионизации пробы (тип ионизатора) Способ
5. Методы ионизации проб в масс-спектрометрах Ионизация электронным ударом (EI, Electron Impact) Химическая ионизация (CI, Chemical Ionization)
6. Ионизация электронным ударом (EI) Анализируемое вещество переводят в газовую фазу (испарение нагревом) и бомбардируют пучком электронов.
7. Электронный удар
8. Химическая ионизация (CI) Источник ионов заполняется газом (метан). Производится ионизация этого газа электронным ударом, а затем
9. Электрораспыление (ESI) Вещество в полярном растворителе (жидкая форма) распыляют через металлический капилляр, к которому приложено высокое
10. Электрораспыление (ESI)
11. Матричная лазерная десорбция (MALDI) Исследуемое вещество помещают в матрицу – низкомолекулярное вещество, активно поглощающее лазерное излучение:
12. Матричная лазерная десорбция (MALDI)
13. Методы разделения ионов (типы масс-анализаторов) Время-пролётное разделение (TOF, Time Of Flight) Квадруполи Ионная ловушка Ионно-циклотронный резонанс
14. Время-пролётное разделение ионов (TOF) После изначального разгона ионов из камеры ионизации на них не действует никакое
15. TOF
16. Разделение с помощью квадруполей Ионный пучок направляют в пространство между четырьмя параллельными электродами (квадруполь), два из
17. Квадруполь
18. Ионная ловушка Похож на квадрупольный анализатор: два электрода (концевые) заземлены, между ними находится кольцевой электрод, на
19. Ионная ловушка
20. Ионно-циклотронный резонанс Ионы влетают в сильное магнитное поле, где начинают двигаться по круговым орбиталям, радиус которых
21. Циклотрон
22. Масс-спектрометрический протеомный анализ I. Анализ de novo. – включает получение индивидуальных препаратов белков, их гидролиз и
23. Масс-спектр триптического гидролизата фрагмента белка M1 вируса гриппа (MALDI-TOF)
24. Масс-спектры разных культур микроорганизмов
25. Масс-спектрометрический протеомный анализ de novo 1. Выделение и очистка смеси белков (протеом) из объекта. 2. Разделение
26. Основные варианты современного протеомного анализа с помощью МС I. MALDI-TOF MS II. HPLC-ESI MS (высокоэффективная жидкостная
27. I. MALDI-TOF Разделение белков с помощью 2D PAGE + гидролиз целевого белка трипсином – получение смеси
28. I. MALDI-TOF: масс-спектрометрия смеси пептидов
29. II. HPLC/ESI MS: Разделение белков в SDS-PAGE + гидролиз целевого белка трипсином – получение смеси пептидов
30. II. HPLC/ESI MS: масс-спектрометрия смеси пептидов с предварительной хроматографией
31. Тандемный масс-спектрометр (MS/MS) Для детального анализа спектра пептидной смеси используют 2 последовательно соединённых через камеру соударений
32. LC-MS/MS
34. Скачать презентацию

Слайд 2

Масс-спектрометрия
Это анализ ионизированных молекул исследуемого вещества (и/или ионов фрагментов молекул) по

отношению массы к заряду (m/z). Анализ проводят в вакууме (чтобы не мешали ионизированные молекулы воздуха).

Слайд 3

Схема масс-спектрометра и этапы анализа
1. Дозатор проб (инжектор)
вводит пробу в масс-спектрометр
2.

Ионизатор проб (источник ионов)
ионизация молекул вещества с фрагментацией или без
3. Анализатор масс
полученные ионы с помощью электрического и/или магнитного полей разделяются в пространстве по отношению m/z
4. Детектор ионов
при соприкосновении с детектором ионы производят электрический сигнал (возникает ток)

Слайд 4

Классификация методов масс-спектрометрии
Для любого метода масс-спектрометрии важны два момента:
Способ ионизации пробы

(тип ионизатора)
Способ анализа отношения масса/заряд (m/z) (тип масс-анализатора)
Эти характеристики отражены в названии конкретного метода масс-спектрометрии (напр., MALDI-TOF, где MALDI – тип ионизатора, TOF – тип детекции m/z).

Слайд 5

Методы ионизации проб в масс-спектрометрах
Ионизация электронным ударом (EI, Electron Impact)
Химическая ионизация

(CI, Chemical Ionization)
Ионизация в электроспрее (электрораспыление) (ESI, Electro-Spray Ionization)
Матричная лазерная десорбция (MALDI, Matrix-Assisted Lazer Desorbtion-Ionization)

Слайд 6

Ионизация электронным ударом (EI)
Анализируемое вещество переводят в газовую фазу (испарение нагревом)

и бомбардируют пучком электронов. Электроны пучка выбивают электроны из молекул – получаются положительно заряженные ионы. При этом происходит разложение молекул на фрагменты (ионы) разного размера.
Недостатки:
анализируемые вещества должны быть летучими и термостабильными – короткие пептиды (~10 АК), химически модифицированные (ацетилирование, метилирование);
ионизация происходит с фрагментацией – можно анализировать только короткие пептиды.

Слайд 7

Электронный удар

Слайд 8

Химическая ионизация (CI)
Источник ионов заполняется газом (метан). Производится ионизация этого газа

электронным ударом, а затем ионизированный газ ионизирует (протонирует) молекулы анализируемого вещества. Это более мягкий вариант по сравнению с EI – молекулы не разбиваются на фрагменты.
Недостаток:
пептиды должны быть летучими и термостабильными (модифицированные короткие пептиды)

Слайд 9

Электрораспыление (ESI)
Вещество в полярном растворителе (жидкая форма) распыляют через металлический капилляр,

к которому приложено высокое напряжение (2,5-4 кВ). Образуется пучок капель с высоким поверхностным зарядом. Растворитель из капель постепенно испаряется (в потоке нагретого инертного газа), силы отталкивания поверхностных зарядов превышают силы поверхностного натяжения – капли дробятся (взрываются) на более мелкие капли. Получаются многозарядные ионы, которые попадают в масс-анализатор.
Преимущества:
можно анализировать нелетучие (длинные) полипептиды (~500 АК)
мягкий метод – фрагментации пептидов не происходит
идеально сочетается с ВЭЖХ
Недостаток:
пептиды должны быть растворимы в полярном растворителе

Слайд 10

Электрораспыление (ESI)

Слайд 11

Матричная лазерная десорбция (MALDI)
Исследуемое вещество помещают в матрицу – низкомолекулярное вещество,

активно поглощающее лазерное излучение: предварительно вещество-образец растворяют вместе с веществом-матрицей в одном растворителе, наносят на подложку и испаряют растворитель. Подложку помещают в прибор и облучают короткими лазерными импульсами. Вещество матрицы испаряется и ионизируется, увлекая за собой молекулы исследуемого вещества, которые тоже ионизируются.
Преимущества:
можно анализировать нелетучие (длинные) полипептиды (длиннее, чем в ESI, ~2000 АК)
мягкий метод – фрагментации пептидов не происходит
обеспечивается высокая чувствительность (фемтомоли, 10-15)
Недостаток:
нужно подбирать вещество матрицы

Слайд 12

Матричная лазерная десорбция (MALDI)

Слайд 13

Методы разделения ионов (типы масс-анализаторов)
Время-пролётное разделение (TOF, Time Of Flight)
Квадруполи
Ионная ловушка
Ионно-циклотронный

резонанс

Слайд 14

Время-пролётное разделение ионов (TOF)
После изначального разгона ионов из камеры ионизации на

них не действует никакое поле, и они движутся по инерции, обладая одинаковой кинетической энергией. Следовательно, более массивные ионы движутся медленнее (детектируются позже), более лёгкие – быстрее (детектируются раньше).
Это один из наиболее частых вариантов детекции в случае исследования пептидов.

Слайд 15

TOF

Слайд 16

Разделение с помощью квадруполей
Ионный пучок направляют в пространство между четырьмя параллельными

электродами (квадруполь), два из которых заряжены положительно, два – отрицательно. На электроды наложено высокочастотное переменное напряжение. Проходя через такое переменное поле, ионы колеблятся, и при заданных частоте и амплитуде переменного поля только ионы с определённым m/z попадают в анализатор.

Слайд 17

Квадруполь

Слайд 18

Ионная ловушка
Похож на квадрупольный анализатор: два электрода (концевые) заземлены, между ними

находится кольцевой электрод, на который подаётся переменное высокочастотное напряжение. Ионы, попав в пространство между электродами, остаются в нём, вращаясь по круговым орбитам, радиус которых зависит от m/z; изменяя частоту и амплитуду переменного поля, можно добиться выхода всех ионов по очереди из области между электродами в детектор.

Слайд 19

Ионная ловушка

Слайд 20

Ионно-циклотронный резонанс
Ионы влетают в сильное магнитное поле, где начинают двигаться по

круговым орбиталям, радиус которых зависит от m/z. Одновременно накладывается внешнее электрическое поле с переменной частотой. При совпадении значения частоты колебаний поля с частотой вращения иона последний поглощает энергию и переходит на более высокую орбиту – детекция сигнала.

Слайд 21

Циклотрон

Слайд 22

Масс-спектрометрический протеомный анализ
I. Анализ de novo.
– включает получение индивидуальных препаратов белков,

их гидролиз и изучение масс-спектра смеси пептидов
II. Анализ белкового профиля (“отпечатки пальцев”) в сравнении с базами данных.
– не требует гидролиза и изучения каждого белка индивидуально, а иногда не требует и выделения белков из биологического образца

Слайд 23

Масс-спектр триптического гидролизата фрагмента белка M1 вируса гриппа (MALDI-TOF)

Слайд 24

Масс-спектры разных культур микроорганизмов

Слайд 25

Масс-спектрометрический протеомный анализ de novo
1. Выделение и очистка смеси белков (протеом)

из объекта.
2. Разделение смеси на отдельные белки (SDS-PAGE или 2D-PAGE).
3. Ферментативный протеолиз белка (трипсин) – получение триптических фрагментов (пептиды).
3а. Разделение смеси пептидов (ВЭЖХ).
4. Определение масс-спектра набора пептидов.
5. Анализ данных (сборка белковой молекулы с помощью протеомной базы данных).

Слайд 26

Основные варианты современного протеомного анализа с помощью МС
I. MALDI-TOF MS
II. HPLC-ESI

MS (высокоэффективная жидкостная хроматография+МС с электрораспылением)
III. (HPLC)-MS/MS (тандемный масс-спектрометр c ВЭЖХ или без)

Слайд 27

I. MALDI-TOF Разделение белков с помощью 2D PAGE
+ гидролиз целевого белка трипсином

– получение смеси пептидов

Слайд 28

I. MALDI-TOF: масс-спектрометрия смеси пептидов

Слайд 29

II. HPLC/ESI MS: Разделение белков в SDS-PAGE
+ гидролиз целевого белка трипсином –

получение смеси пептидов

Слайд 30

II. HPLC/ESI MS: масс-спектрометрия смеси пептидов с предварительной хроматографией

Слайд 31

Тандемный масс-спектрометр (MS/MS)
Для детального анализа спектра пептидной смеси используют 2 последовательно

соединённых через камеру соударений масс-спектрометра:
в первом проводится ионизация без фрагментации и разделение ионов (ESI, реже MALDI);
в камере соударения проводится фрагментация полученных ранее ионов (столкновение с атомами аргона, метод бомбардировки быстрыми атомами – FAB)
во втором МС набор фрагментов ионов (дочерних) разделяется и детектируется

Слайд 32

Массспектрометрическое (МС) секвенирование белков

Содержание

Масс-спектрометрияЭто анализ ионизированных молекул исследуемого вещества (и/или ионов фрагментов молекул) по

Схема масс-спектрометра и этапы анализа1. Дозатор проб (инжектор)вводит пробу в масс-спектрометр2.

Классификация методов масс-спектрометрииДля любого метода масс-спектрометрии важны два момента:Способ ионизации пробы

Методы ионизации проб в масс-спектрометрахИонизация электронным ударом (EI, Electron Impact)Химическая ионизация

Ионизация электронным ударом (EI)Анализируемое вещество переводят в газовую фазу (испарение нагревом)

Электронный удар

Химическая ионизация (CI)Источник ионов заполняется газом (метан). Производится ионизация этого газа

Электрораспыление (ESI)Вещество в полярном растворителе (жидкая форма) распыляют через металлический капилляр,

Электрораспыление (ESI)

Матричная лазерная десорбция (MALDI)Исследуемое вещество помещают в матрицу – низкомолекулярное вещество,

Матричная лазерная десорбция (MALDI)

Методы разделения ионов (типы масс-анализаторов)Время-пролётное разделение (TOF, Time Of Flight)КвадруполиИонная ловушкаИонно-циклотронный

Время-пролётное разделение ионов (TOF)После изначального разгона ионов из камеры ионизации на

TOF

Разделение с помощью квадруполейИонный пучок направляют в пространство между четырьмя параллельными