Генетика клеточного цикла. Надклеточный контроль клеточного деления, роста и апоптоза. (Глава 5)

контроля G2/М р53 блокирует циклин В/Cdk через инактивацию фосфатазы Cdc25
Сенсоры стресса Growth Arrest DNA Damage (GADD 45) у млекопитающих

Действие р53
в разные периоды цикла

Growth Arrest DNA Damage (Gadd) 45

(MMS)
радиация метилметан сульфонат
P53
GADD
Арест цикла Индукция апоптоза

cdc2 (связывается и ингибирует)
MEKK (связывается и активирует JNK каскад )
PCNA (proliferating cell nuclear antigen) прикрепляет ДНК-полимеразу δ к матрице (GADD связывается и модулирует работу ДНК-полимеразы )

GADD 45-α,ß,γ- очень кислые маленькие белки (18 kDa) с отрицательным зарядом -9 ... -12

TGFß- индуцированный апоптоз

от числа клеток и их массы. Число клеток определяется их рождением и гибелью
Экстраклеточные сигналы, регулирующие эти процессы, часто называют «факторы роста» в широком смысле. Для точного выражения следует различать:
Митогены – стимулируют клеточные деления, снимая внутриклеточный блок с продвижения по циклу.
Ростовые факторы – стимулируют увеличение массы клетки, вызывая синтез макромолекул и ингибируя их деградацию
Факторы выживания – супрессируют апоптоз

клеток высших организмов необходимы различные специфические ростовые факторы.
2. Клетка может взаимодействовать с несколькими факторами роста; один и тот же фактор роста может влиять на разные типы клеток.
3. Реакция на ростовой фактор специфична для каждого типа клеток.

окраска на апоптоз

Апоптоз происходит:
Эмбриогенез и дифференцировка
Физиологическое обновление клеток
Атрофия, вызванная действием факторов некроза опухолей
Вирусные заболевания (СПИД)
Нейродегенеративные заболевания (б. Альцгеймера, б. Гатчинсона)

культуре

Фагоцитоз клетки, гибнущей апоптозом

фрагментируются, образуются «апоптозные тела».
Молекулярные изменения:
Возрастает концентрация Са2+
Активируются протеазы-каспазы
Разрушение ламины.
Разрезание белка, инактивирующего эндонуклеазу.
ДНК режется на фрагменты
Клеточная поверхность меняется- теряется сиаловая кислота на гликопротеинах и гликолипидах-, что вызывает быстрый фагоцитоз клетки макрофагами или соседями
На мембране появляются рецепторы витронектина, притягивающие макрофаги, фосфатидилсерин появляется на внешнем мембранном слое, фосфатидилсерин появляется на внешнем мембранном слое,

по аспарагиновой кислоте –
caspases
Каспазы синтезируются в виде прокаспаз, хранятся в клетке долгое время.
Активируются другими каспазами разрезанием по аспарагиновой
кислоте. Амплификация протеолитического каскада.

на поверхности клетки:
Fas кластеризуются, к ним присоединяются адапторные белки
и прокаспазы. Взаимная активация и каскад.
Некоторые стрессированные или поврежденные клетки убивают себя
сами, продуцируя и Fas-лиганд, и Fas-рецептор.

Цитохром с
присоединяется
к адапторному
протеину Apaf-1.
Белки Bax и Bak вызывают
выброс белка
межмембранного
пространства
митохондрий за счет
пермеабилизации внешней
мембраны

Активация апоптоза изнутри клетки

в культуре делились с добавлением сыворотки крови и не делились в плазме.
Плазма – забирают жидкую часть крови без образования сгустка.
Сыворотка – то же после образования сгустка.
Клетки делились при добавлении экстракта фибробластов
В организме тромбоциты стимулируют деление клеток при заживлении ран.
EGF –epidermal growth factor
PDGF (фибробласты, гладкие мышечные, нейроглиальные) и EGF – широкого спектра дейстия

Эритропоэтин – только для эритроцитов
TGF-β – трансформирующий фактор роста – одни клетки стимулирует, другие ингибирует

гена myc

?

Многие компоненты внутриклеточных сигнальных путей оказываются онкогенами

Alberts et al., 2002

Активация транскрипции генов, связанных с выходом из G0

часто вызывает рак (рак толстой кишки, мочевого пузыря, поджелудочной железы, лёгкого -30% всех случаев )
Мутация 1 ак в Ras –перманентная активность, постоянная стимуляция сигнального пути

Гиперактивация гена myc – мелкоклеточный рак лёгкого, рак толстой кишки, лимфома

Участники сигнального пути Ras и myc в онкогенезе

митогеном сигнального пути Ras

Тирозин киназа

Протоонкогены – гены, в норме стимулирующие деление клетка. Мутация с приобретением функции (доминантная) превращает его в онкоген.
Туморсупрессоры – гены, в норме подавляющие клеточные деления. Функция утрачивается в результате мутациях в обоих генах (рецессивные).

Alberts et al., 2002

эритробластоза птиц)
Рецептор колониестимулирующего фактора M-CSF (саркома кошки)

Тирозин киназа

Участники сигнального пути Ras и myc в онкогенезе

Фосфотирозины рецептора служат докинг-сайтом для различных белков, имеющих домены SH2 (src homology region-пролин-богатые), SH3, в т.ч. Src-тирозинкиназы, PTB (phosphotyrosine binding)-домены,
Активация пути myc

Тирозин-фосфатазы специфические для определенного класса рецепторов, обеспечивают быструю отмену сигнала

необходимо фосфорилирование треонина и тирозина одновременно
Входит в ядро и фосфорилирует другие киназы и гено-регуляторный комплекс, активируя транскрипцию «непосредственно ранних генов» через минуты после сигнала – это myc-ген

Raf
и
Mek
Erk
у млек.

Alberts et al., 2002

мелкоклеточный рак лёгкого, рак толстой кишки, лимфома

Участники сигнального пути Ras и myc в онкогенезе

точки контроля. Нормальная клетка в состоянии различить аномальную стимуляцию.

Повышенная стимуляция митогенного пути индуцирует арест клеточного цикла или апоптоз

Индуцируется синтез
ингибиторного белка р19ARF,
который присоединяется
к Mdm2 и ингибирует его.
Возрастает уровень р53
– арест или апоптоз

В раковых клетках эта система часто инактивируется мутациями в компонентах точки контроля

Alberts et al., 2002

р27

фибробластов через 25-50 делений в среде с митогенами наступает арест клеточного цикла. Активация пути р53 в ответ на повреждения теломер.
У грызунов теломераза активна. Контроль над делениями осуществляется механизмом p19ARF. Мутации в нем могут приводить к «бессмертию» культуры клеток
Количество белка CKI p27 прогрессивно нарастает в клетках, которые делятся определенное число раз, прежде чем войдут в перманентный арест при терминальной дифференцировке.
У мышей, дефицитных по р27, общее число клеток увеличено

ростовой фактор.
Увеличение скорости синтеза макромолекул и снижение скорости деградации
Путь PI 3- фосфатидилинозитол-3-киназы.

S6 киназа фосфорилирует белок S6 рибосом – трансляция набора mРНК, кодирующего рибосомные компоненты
Мутация в гене S6 киназы у дрозофилы: мухи мелкие, клетки мелкие, число нормальное
Активация трансляции фактором инициации трансляции eIF4E
Увеличение продукции регуляторного белка Myc. Он увеличивает транскрипцию белков, вовлеченных в клеточный метаболизм и синтез макромолекул

домены

Фосфотирозины служат докинг-сайтом для различных белков, имеющих домены SH2 (src homology region), SH3

PI3-киназа

GTPase активирующий белок

Фосфолипаза С -PLC

(src homology region), SH3

митоген одновременно: PDGF –фактор роста тромбоцитов

Ras

PI3-kinase

MAP-kinase

Myc

Рост клетки

Деление клетки

Связь роста и
пролиферации
гарантирована

В некоторых клетках рост и пролиферация контролируются независимо (эмбриогенез). Симпатический нейрон исключен из цикла, но растет пропорционально количеству NGF (nerve grows factor), который выделяет клетка-мишень

Культура нейральных предшественников:
EGF- подъем МАР-активности через 5 мин и
быстрое снижение, деления
NGF- MAP-активность высока часами,
Остановка пролиферации, дифференцировка

Выживание
клетки

внутриклеточных сигнальных белков

Инозитол фосфолипид фосфатаза

Alberts et al., 2002

в избытке и конкурируют за фактор, выделяемый мишенями

PDK1 - PI-dependent kinase
PKB-протеинкиназа В уходит в цитоплазму, фосфорилирует многие белки, ингибирует апоптоз (повышенный уровень во многих опухолях)

Alberts et al., 2002

Внеклеточные факторы, супрессирующие апоптоз

Факторы выживания

в т.ч. PKB.

Bad ингибирует Bcl-2

РКВ:
1. Активирует ингибитор апоптоза Bcl-2.
2. Ингибирует гены, вызывающие апоптоз

Alberts et al., 2002

в составе комплекса белков пассажиров необходим для правильного расхождения хромосом
В. Экспорт Survivin из ядра ингибирует апоптоз. При химиотерапии раковых опухолей концентрация Survivin в ядрах раковых клеток является благоприятным для пациента признаком

Содержит бакуловирусный IAP повтор, ингибирует эффекторные каспазы. Высокоактивен в опухолевых и фетальных клетках, отсутствует в терминально дифференцированных 

с большей экспрессией, собаки мелких пород – слабоэкспрессирующийся аллель.
У человека в промоторе гена обнаружен вариабельный участок, состоящий из CA-повторов, число которых может варьировать от 10 до 24 (в среднем их 19). Данные говорят о корреляции числа CA-повторов с уровнем экспрессии гена. В одинаковой степени как малое, так и большое число этих повторов ассоциируется со снижением циркуляции IGF-1. Носители 19 CA-повторов (их также называют носителями аллеля 192) в процессе тренировок развивают силу в большей степени, чем носители других аллелей.

Рецептор инсулиноподобного фактора роста IGFR-1
У долгожителей (старше 100 лет) и их детей чаще встречались мутации рецептора к инсулиноподобному фактору роста-1. У носителей мутаций был нарушен процесс связывания клеток с ИФР-1, повышение уровня ИФР-1 в крови на 37%
Каскад IGFR-1 влияет на продолжительность жизни

ингибирование клеточных делений = зависимое от плотности

Постоянно добавляется свежая среда

Монослой, нет пролиферации

Пролиферация

Пролиферация в потоке возобновляется

Плотность определяется доступностью экстраклеточных факторов

Alberts et al., 2002

вступления в S фазу

В среду добавили Н3-тимидин, через 1-2 дня зафиксировали и авторадиографи-ровали

8% 30% 90%

Alberts et al., 2002

субстрате, покрытом фибронектином (внеклеточный матрикс).
Фокальная адгезия – места контактов: актин – интегрин - фибронектин. В местах кластеризации интегринов - фокальный контакт - активация тирозин киназы FAK (фокальной адгезии), прикрепление к цитоплазматическим хвостам интегринов, кроссфосфорилирование
друг друга.
Сайты SH, присоединение киназы Src.
Две киназы продуцируют сигналы о прикреплении.

Выживание, рост, деление и перемещение.
FAK-focal adhesion kinase – активирует внутриклеточный сигнал, разрешающий выживание, рост и деление клетки.
Мыши, дефицитные по FAK, погибают в раннем развитии

актин, красный- белки, содержащие фосфотирозин, оранжевый – точки перекрывания двух компонентов
Метод FRET

Alberts et al., 2002

transducers and activators of transcription
Лиганды:
интерфероны α и γ (активация макрофагов, увеличение устойчивости к вирусной инфекции),
Эритропоэтин (выживание, пролиферация и дифференцировка эритроидного ряда),
гормон роста,
пролактин

киназных домена-цитоплазматические тирозин-киназы, соединяют соседние рецепторы и перекрестно фосфорилируют их по тирозинам

К фосфотирозинам пристыковываются белки STAT и фосфорилируются

как гормоны или локальные медиаторы, градуирующие морфогены.
Суперсемейство: TGF-β, активины и BMP
TGF-β ингибирует пролиферацию нескольких типов клеток, блокируя клеточный цикл в G1 или стимулируя апоптоз. Градуирующие морфогены в эмбриогенезе
Рецепторы TGF-β - серин-треонин киназы.
Активируется путь Smads. Изменения в транскрипции генов, регулирующих клеточные деления, дифференцировка, образование внеклеточного матрикса и смерть.
BMP- bone morphogenetic protein из семейства TGF-β. Помогает включить апоптоз в тканях между развивающимися пальцами, в молочной железе
Myostatin (то же семейство) – ингибирует пролиферацию миобластов.

или локальные медиаторы
Представитель суперсемейства родственных полипептидов, участвующих в клеточной дифференцировке и эмбриогенезе (Dpp(dros)=BMP4(mam)). Формирование костей, хрящей, развитие половых органов.
Выполняют функции факторов роста и подавляют рост.
Чаще противодействуют митогенам, вызывая задержку клеточного цикла и развитие морфологических структур эмбриона. Стимулирует:
- синтез белков внеклеточного матрикса (коллагены 1, 4, фибронектин)
- остеогенную активность
- рост симпатических нейронов
дифференцировку клеток гладкой мускулатуры
Хемотаксический фактор для моноцитов, фибробластов, астроцитов.
Подавляет пролиферацию и функцию Т и В-лимфоцитов, эндотелиальных и эпителиальных клеток.
Вызывает апоптоз (перепонка между пальцами, молочная железа)
Секретируется определенными бластомерами, вызывая гаструляцию

Гомодимеры, масса 25 кДа. Секретируются в виде предшественника и активируются протеолизом

Внеклеточные сигналы, ингибирующие рост

TGF-β - серин-треонин киназы.

Alberts et al., 2002

киназы.

Туморсупрессор Рецептор TGF-β II (30% при раке прямой кишки)
Туморсупрессор Smad4 (рак поджелудочной и др.)

TGF-β ингибирует пролиферацию нескольких типов клеток, блокируя клеточный цикл в G1 или стимулируя апоптоз. Градуирующие морфогены в эмбриогенезе

Белки Smad могут активироваться
Src-киназой

при нормальном высасывании;
В – Через 9 часов после прекращения высасывания, экспрессия TGFβ3;
С – Через 3 суток после прекращения высасывания, начало апоптоза
А В С

Alberts et al., 2002

в М2

Далее 11 синхронных делений дробления
Рост отсутствует

Созревание
Транскрипция подавлена, трансляция

Стадия VI
Синтез mРНК

Созревание:
Конверсия
пре MPF
в активный MPF,
GVBD-germinal
vesicle breakdown,
Завершение мейоза 1, выброс первого полярного тельца

мембране и вызывает уменьшение уровня cAMP.
Неклассический прогестероновый рецептор имеет негеномный эффект на созревание ооцита.
В процессе участвуют G-protein coupled receptors (7 раз пронзает мембрану) и вызывает уменьшение уровня cAMP.

Созревание ооцита

запускает созревание ооцита.
Проходит первое деление, арест в М II.

Ríos-Cardona D et al., 2008