Praktická cvičení z biochemie

Содержание

Слайд 2

1. METODY MĚŘENÍ pH A POTENCIOMETRICKÁ TITRACE pH a izoelektrický bod

1. METODY MĚŘENÍ pH A POTENCIOMETRICKÁ TITRACE

pH a izoelektrický bod

pH =

vodíkový exponent/potenciál vodíku - udává zda roztok reaguje kysele či zásaditě
záporný dekadický logaritmus koncentrace oxoniových (vodíkových) kationtů
Amfion = částice obsahující jak pozitivní, tak negativní elektrický náboj (navenek je elektricky negativní) – celkový náboj je nulový
nejčastěji to bývají aminokyseliny (peptidy, bílkoviny)
Izoelektrický bod = hodnota pH při které se látka nachází ve stavu amfionu, takže se nepohybuje v elektrickém poli (pI = pH izoelektrického bodu)
abychom zabránily vnějším vlivům působící změnu pH používáme pufry
tlumivé roztoky kyseliny nebo zásady a její soli
V těle např.: bikarbonátové pufry, hemoglobinové pufry, fosfátové pufry
Proteinátové ionty = bílkoviny plazmy, které při pH=7,4 jsou ve stavu kationtů
Слайд 3

1. METODY MĚŘENÍ PH A POTENCIOMETRICKÁ TITRACE Potenciometrie Elektrochemická analytická metoda,

1. METODY MĚŘENÍ PH A POTENCIOMETRICKÁ TITRACE

Potenciometrie

Elektrochemická analytická metoda, při níž

se pomocí pH metru měří rovnovážné napětí mezi dvěma elektrodami.
První elektroda je indikační (měrná) a jí měřený potenciál je závislý na koncentraci iontů v roztoku, ve kterém je ponořena.
Druhá elektroda je referentní (srovnávací) s konstantním potenciálem, nezávislým na koncentraci iontů v okolním roztoku.
Využití změřeného potenciálového rozdílu - přímo /zjištění pH/
- nepřímo /potenciometrické titrace/

Jednoduché metody ? nejsou velmi přesné.
indikátorové papírky
kolorimetrické metody - optické metody založené na porovnávání intenzity zabarveného roztoku o neznámé koncentraci s roztokem téže látky o známé koncentraci.
pH metry ? velká přesnost (odchylky o 0,01 pH)

Metody měření pH

Слайд 4

1. METODY MĚŘENÍ pH A POTENCIOMETRICKÁ TITRACE Potenciometrie Velikost potenciálu závisí

1. METODY MĚŘENÍ pH A POTENCIOMETRICKÁ TITRACE

Potenciometrie

Velikost potenciálu závisí hlavně na

koncentraci iontů v roztoku
Hodnotu potenciálu zjistíme pomocí Nernstovy rovnice:
Jako standard (E0) zvolena tzv. standardní vodíková elektroda - potenciál při 25°C = 0,00 V
Přístroje pro měření = pH-metry - cejchované v mV i jednotkách pH ( E=k.pH )
Přístroje pro měření koncentrace iontů = ionometry
Nejdůležitější součást přístrojů - elektrody
Měrné elektrody - potenciál závislý na koncentraci iontů v roztoku (Nernstova rovnice) - elektroda skleněná
Srovnávací elektrody - kalomelová elektroda, argentchloridová elektroda, merkurfosfátová elektroda
Kombinované elektrody - nejčastěji ze skleněné a kalomelové elektrody
Mikroelektrody - měření za anaerobních podmínek v mikrolitrech /měření pH krve/
Слайд 5

1. METODY MĚŘENÍ PH A POTENCIOMETRICKÁ TITRACE Potenciometrická titrace Při potenciometrické

1. METODY MĚŘENÍ PH A POTENCIOMETRICKÁ TITRACE

Potenciometrická titrace

Při potenciometrické titraci se

sleduje závislost potenciálu na objemu
spotřebovaného titračního činidla.
Výsledkem je titrační křivka, která má charakteristický esovitý tvar.
Spotřeba titračního roztoku v ekvivalentním bodě se odečte z grafu nebo se získá výpočtem.
Ekvivalentní bod = stav, při kterém je látkové množství titračního činidla ekvivalentní látkovému množství stanovované látky
Výhody: objektivita, nezávislost na volbě indikátoru, možnost titrovat roztoky zakalené barevně.
Pro přesnost stanovení je důležité spolehlivé a přesné měření objemů.
Vzorce pro výpočet látkové a hmotností koncentrace vzorku:
Слайд 6

1. METODY MĚŘENÍ PH A POTENCIOMETRICKÁ TITRACE Tvary titračních křivek

1. METODY MĚŘENÍ PH A POTENCIOMETRICKÁ TITRACE

Tvary titračních křivek

Слайд 7

2. FOTOMETRIE optická metoda analytické chemie zabývá se vlastností chemických látek

2. FOTOMETRIE

optická metoda analytické chemie
zabývá se vlastností chemických látek pohlcovat část

elektromagnetického záření (nejčastěji světla, IR, UV)
pro látky je specifické pohlcovat různé části spekter s různou intenzitou
dle jejich absorpčních vlastností můžeme zjišťovat koncentrace látek v roztoku či jeho složení
Absorpce záření - lze sledovat pomocí absorpčního spektra (závislosti množství absorbovaného záření na vlnové délce/vlnočtu)
měření tzv. absorbance dané látky (spektro)fotometrem
ZÁKON LAMBERTŮV-BEERŮV
Prochází-li paprsek monochromatického záření optickou vrstvou, která toto záření pohlcuje, intenzita původního záření se zeslabí.

Zákon platí pro monochromatické světlo a vyjadřuje vztah mezi absorbancí(A), Tloušťkou absorbujícího prostření (l) a jeho koncentrací (c)

Слайд 8

2. FOTOMETRIE Transmitance /propustnost/ - poměr intenzity záření prošlého k intenzitě

2. FOTOMETRIE

Transmitance /propustnost/ - poměr intenzity záření prošlého k intenzitě záření

původního
Hodnoty 0 - 1 (0 - 100% )
Absorbance /extinkce/ - logaritmický poměr intenzity původního záření k intenzitě záření prošlého
Hodnoty 0 - ∞
Při absorbanci A= 0 (T = 1) se záření vůbec neabsorbuje / při absorbanci A= ∞ (T= 0) se záření pohltí úplně
absorbanci měří přístroj (fotometr) skrze kyvetu s roztokem jež do přístroje vkládáme
Absorpční křivka – specifická křivka pro chemická činidla jež ukazuje závislost absorpce záření na vlnové délce
Kalibrační křivka – přímá úměrnost koncentrace látky a její absorbance
kontrola L-B zákona vynesením závislosti A= f(c)
Слайд 9

3. POLARIMETRIE založená na měření optické otáčivosti - stočení roviny polarizovaného

3. POLARIMETRIE

založená na měření optické otáčivosti - stočení roviny polarizovaného světla

opticky aktivní látkou
OPTICKY AKTIVNÍ LÁTKY
Schopnost otáčet rovinu polarizovaného světla
Většinou organické sloučeniny s asymetrickým uhlíkem =chirální uhlík - nese 4 odlišné substituenty
(dále: anorganické látky s asymetrickou molekulou, krystaly)
Podle smyslu otáčení:
PRAVOTOČIVÉ (+) a LEVOTOČIVÉ (-)
Úhel otočení souvisí se strukturou látky a koncentrací
Charakterizující konstanta opticky aktivních látek - Měrná otáčivost
Závisí na vlnové délce, teplotě a koncentraci
Měření optické otáčivosti polarimetrem
Слайд 10

3. POLARIMETRIE Měřením získáme úhel otočení (ve stupních) potřebný pro vypočítání

3. POLARIMETRIE

Měřením získáme úhel otočení (ve stupních) potřebný pro vypočítání koncentrace

látky
VYUŽITÍ POLARIMETRIE:
Kontrola čistoty směsí chirálních látek,
Měření koncentrace sacharidů v cukrovarnictví a potravinářském průmyslu
ve farmacii a biochemii stanovení bílkovin, steroidů, vitamínů či alkaloidů
Слайд 11

OSMÓZA: Dva různě koncentrované roztoky od sebe odděleny semipermeabilní membránou propustnou

OSMÓZA:
Dva různě koncentrované roztoky od sebe odděleny semipermeabilní membránou propustnou

pouze pro molekuly rozpouštědla
část rozpouštědla přejde z místa nižší koncentrace do místa s vyšší koncentrací tak, aby došlo k vyrovnání rozdílu
OSMOTICKÝ TLAK:
tlak, který musíme vyvinout na koncentrovanější roztok, aby se zabránilo osmóze.
ONKOTICKÝ TLAK:
osmotický tlak bílkovinné složky plazmy a činí cca 0,3% celkového osmotického tlaku plazmy.
REVERZNÍ OSMÓZA
na roztok působí tlak, která je od čistého rozpouštědla oddělen polopropustnou membránou
Při dostatečném tlaku dochází k opačnému toku rozpouštědla než u osmosy

DIFUZE
je pohyb částic ve směru koncentračního gradientu, tak aby došlo k vyrovnání koncentrace ve všech místech soustavy
důsledkem neuspořádaného pohybu částic (nezávisle na gravitaci)

5. OMOSA, MĚŘENÍ A PORUCHY OSMOLALITY, DIALYSA

Слайд 12

Příklady osmózy 5. OMOSA, MĚŘENÍ A PORUCHY OSMOLALITY, DIALYSA

Příklady osmózy

5. OMOSA, MĚŘENÍ A PORUCHY OSMOLALITY, DIALYSA

Слайд 13

OSMOLALITA Pro vyjádření osmotických poměrů v roztoku Vyjadřuje celkové látkové množství

OSMOLALITA
Pro vyjádření osmotických poměrů v roztoku
Vyjadřuje celkové látkové množství všech osmoticky

aktivních částic rozpuštěných v jednotkové hmotnosti čistého rozpouštědla
Jednotkou je mol/kg resp. mmol/kg
Osmolalitě 1mol/kg odpovídá osmotický tlak 2,7 Mpa
Osmolalita moči: 50-1400 mmol/kg H2O – v rozmezí se pohybuje v závislosti na pitném režimu a koncentraci iontů v organismu
TONICITA
Rozdíl osmotického tlaku mezi prostředími
V lidské fyziologii ve krevní plasmě
IZOTONICKÝ ROZTOK - stejný osmotický tlak jako plasma
HYPOTONICKÝ ROZTOK - nižší osmotický tlak než plasma
HYPERTONICKÝ ROZTOK - vyšší osmotický tlak než plasma

5. OMOSA, MĚŘENÍ A PORUCHY OSMOLALITY, DIALYSA

Слайд 14

5. OMOSA, MĚŘENÍ A PORUCHY OSMOLALITY, DIALYSA DIALÝZA Dělící metoda, při

5. OMOSA, MĚŘENÍ A PORUCHY OSMOLALITY, DIALYSA

DIALÝZA
Dělící metoda, při niž se

uplatňuje difúze a současně polopropustnost membrány
děj, při kterém jsou od sebe odděleny látky s různou rozpustností a velikostí molekul
Prakticky se tak děje přechodem analyticky disperzních látek přes polopropustnou membránu z prostředí s vyšší koncentrací těchto látek do prostředí s nižší koncentrací
HEMODIALÝZA
metoda odstraňování odpadních látek jako např. draslík, močovina, a nadbytečné vody z krve při selhání ledvin
Krev pacienta proudí kolem semipermeabilních membrán, které dovolují vyrovnání koncentrací nízkomolekulárních látek s dialyzačním roztokem na druhé straně membrány, zatímco plasmatické proteiny a krevní buňky přes dialyzační membránu neprocházejí a neztrácení se
PERITONEÁLNÍ DIALÝZA - na rozdíl od hemodialýzy využívá peritoneum pacienta
DIALYZAČNÍ ROZTOK - vodný roztok obsahující glukózu a různé ionty (např. draselné, sodné…)
Слайд 15

5. OMOSA, MĚŘENÍ A PORUCHY OSMOLALITY, DIALYSA KRYOSKOPIE Metoda založena na

5. OMOSA, MĚŘENÍ A PORUCHY OSMOLALITY, DIALYSA
KRYOSKOPIE
Metoda založena na kryoskopickém efektu

- snížení teploty tuhnutí rozpouštědla po rozpuštění dané látky
Měření kryoskopem (osmometrem)
KRYOSKOPICKÝ EFEKT - snížení teploty tuhnutí
EBULIOSKOPICKÝ EFEKT - zvýšení bodu varu
Vlastnost závisí na počtu částic, ne na jejich identitě
Rozdíl teplot tuhnutí a čistého rozpouštědla je přímo úměrný osmolalitě a nepřímo úměrný molární hmotnosti rozpuštěné látky
Слайд 16

???otázka??? ANTIOXIDANTY Při metabolických pochodech vznikají reaktivní formy kyslíku ROS a

???otázka??? ANTIOXIDANTY

Při metabolických pochodech vznikají reaktivní formy kyslíku ROS a

reaktivní formy dusíku RNS
Souhrnně označované jako RONS
Zahrnují volné radikály i látky neradikálové povahy
Слайд 17

???otázka??? ANTIOXIDANTY látky schopné reagovat a ukončit existenci volných radikálů Vyčerpání

???otázka??? ANTIOXIDANTY

látky schopné reagovat a ukončit existenci volných radikálů
Vyčerpání antioxidantů

v těle vede k poškození tkáně v důsledku procesů označovaných jako oxidační stres (sportování, psychický stres…)
Antioxidační kapacita - míra schopnosti tkáně odolávat oxidačnímu stresu, závislá na množství a druhu antioxidantů ve tkáni
VOLNÉ RADIKÁLY
= molekuly, atomy či ionty, schopné samostatné existence mající alespoň jeden volný nepárový elektron ve valenční sféře
Vznikají: 1) Homolitické štěpení kovalentní vazby na dvě částice
2) Redukce -přidáním jednoho elektronu
3) Oxidací -ztrátou jednoho elektronu
Šíří se jako řetězová reakce. Volný radikál se stabilizuje vytržením elektronu z nejbližší molekuly, která se pak stává radikálem.
Слайд 18

???otázka??? ANTIOXIDANTY PŘÍČINY VZNIKU RADIKÁLŮ Do organizmu se volné radikály dostávají

???otázka??? ANTIOXIDANTY

PŘÍČINY VZNIKU RADIKÁLŮ
Do organizmu se volné radikály dostávají z

vnějšího prostředí, ale celá řada z nich vzniká i během metabolických procesů
Rozdělujeme příčiny jejich vzniku na exogenní a endogenní:
Exogenní: ionizující záření, UV záření, vysoký obsah škodlivin ve vzduchu, kouření, intoxikace, potrava
Endogenní: vznik kyseliny močové, rozpad fagocytů a makrofágů, vznik methemoglobinu, syntéza prostaglandinů, zvýšený metabolizmus estrogenů, autooxidace thiolů, hyperglykémie
DISMUTACE A FENTONOVA REAKCE
Protože se superoxidový radikál řadí mezi nestabilní molekuly, v organizmu snadno podléhá dismutaci za vzniku zmíněného peroxidu vodíku:
O2-· + O2-· ? O2+ H2O2
Ten je relativně stabilní a má schopnost pronikat v tělních tekutinách i do větších vzdáleností. S biologickými molekulami reaguje velmi pomalu a jeho reakcí s dvoumocným železem vzniká hydroxylový radikál (Fentonova reakce):
H2O2 + Fe2+ ?Fe3+ + ·OH + OH- .
Trojmocné železo může být redukováno superoxidem, takže se kruh pro další uzavírá.
Слайд 19

???otázka??? ANTIOXIDANTY NERADIKÁLY neradikály mohou snadno v radikály přecházet a tím

???otázka??? ANTIOXIDANTY
NERADIKÁLY
neradikály mohou snadno v radikály přecházet a tím mohou

poškozovat buňku
mohou vznikat reakcí dvou radikálů (-> nepřímo nám řeknou, že v těle radikály jsou)
NO• + O2•- ——→ OONO-
Peroxynitrit OONO- je silné oxidační činidlo
Fentonova reakce:
H2O2 + Fe2+ → HO• + OH− + Fe3+
místo železa může být i jiný přechodný kov (Cu,Zn,..)
hydroxylový radikál HO• je silné oxidační činidlo
vytrhuje elektron z nenasycených mastných kyselin
hydroxyluje AMK a baze NK
Слайд 20

8. ROZDĚLOVACÍ A ADSORPČNÍ CHROMATOGRAFIE CHROMATOGRAFIE Dělící metoda, při niž se

8. ROZDĚLOVACÍ A ADSORPČNÍ CHROMATOGRAFIE
CHROMATOGRAFIE
Dělící metoda, při niž se distribuují složky

mezi stacionární a mobilní fází
Mobilní fáze - kapalina nebo plyn
Stacionární fáze - pevná látka nebo kapalina
Složka s velkou KD je převážně ve stacionární fázi a bude se pohybovat pomaleji než složka v malou KD, která je převážně ve fázi mobilní
Čím více se látka váže na stacionární fázi, tím pomaleji se pohybuje
Čím více se látka váže na fázi mobilní, tím rychleji se pohybuje
Слайд 21

8. ROZDĚLOVACÍ A ADSORPČNÍ CHROMATOGRAFIE ROZDĚLENÍ CHROMATOGRAFICKÝCH METOD PODLE ZPŮSOBU PROVEDENÍ

8. ROZDĚLOVACÍ A ADSORPČNÍ CHROMATOGRAFIE

ROZDĚLENÍ CHROMATOGRAFICKÝCH METOD PODLE ZPŮSOBU PROVEDENÍ
SLOUPCOVÁ CHROMATOGRAFIE

(chromatografie na koloně)
Kolona - trubice naplněná chromatograficky aktivním materiálem
Udává se poměr vnitřního průměru kolony a délky sloupce pevné fáze
Impregnace - zakotvení stacionární fáze na nosič ? nanesení vzorku ? vyvýjení
Eluát - mobilní fáze vytékající z kolony
v průběhu eluce se postupně sbírají frakce buď ve stejných časových intervalech nebo se odebírá stejný objem
Vyhodnocení nejčastěji fotometricky, grafickým znázerněním průběhu eluce - eluční křivka
CHROMATOGRAFIE V PLOŠNÉM USPOŘÁDÁNÍ
Stacionární fáze - arch chromatografického papíru nebo tenká vrstva adsorbentu na pevné podložce
Obvykle pouze identifikace látek, práce se standardy
Identifikace látek pomocí retardačního faktoru Rf
Místo nanesení vzorku - start
Poloha mobilní fáze v okamžiku přerušení vyvíjení - čelo
Retardační faktor = poměr vzdálenosti start - těžiště skvrny vzorku (A) ku vzdálenosti start - čelo (B)
Слайд 22

ROZDĚLOVACÍ CHROMATOGRAFIE Stacionární fáze je kapalina (na vhodném nosiči), která se

ROZDĚLOVACÍ CHROMATOGRAFIE
Stacionární fáze je kapalina (na vhodném nosiči), která se nemísí

s kapalinou mobilní fáze
K dělení dochází, mají-li látky rozdílné rozdělovací konstanty
Chromatografický papír
stacionární fáze – voda vázaná asi 5% na celulosu
mobilní fáze – organické rozpouštědlo nebo jejich směsi s vodou
dělení:
vzestupná – rozpouštědlo zdola nahoru
sestupná – naopak
kruhová – radiálně od středu papíru
dvojrozměrná – nejprve v jednom směru a poté ve směru kolmém na směr první
Vyvíjení ve skleněných uzavřených komorách ? usušení chromatogramu ? postříkat vhodným činidlem(výrazná barevná reakce), někdy UV detekce
Vyhodnocení pomocí retardačního faktoru a srovnání s paralelně nanesenými standardy
Rf=A/B
A=start-těžiště skvrny,
B=start-čelo

8. ROZDĚLOVACÍ A ADSORPČNÍ CHROMATOGRAFIE

Слайд 23

ADSORPČNÍ CHROMATOGRAFIE Stacionární fáze - pevná látka s adsorpčními vlastnostmi mobilní

ADSORPČNÍ CHROMATOGRAFIE
Stacionární fáze - pevná látka s adsorpčními vlastnostmi
mobilní fáze

- kapalina nebo plyn
Směsi se dělí na základě rozdílné adsorpční afinity stacionární fáze k molekulám rozpuštěných látek.
TLC – TENKOVRSTVÁ CHROMATOGRAFIE
Mobilní fáze - organické rozpouštědlo
Tenká vrstva stacionární fáze - oxid křemičitý spojený sádrou nebo škrobem (v případě dělení rostlinných pigmentů), vhodný hydrofilní absorbent je oxid hlinitý ? poutá nejpevněji vodu.
Vlastní vzorek není ponořen do rozpouštědla, ale rozpouštědlo se na start dostává jen vzlínáním

8. ROZDĚLOVACÍ A ADSORPČNÍ CHROMATOGRAFIE

Слайд 24

IONTOVĚ VÝMĚNNÁ CHROMATOGRAFIE (IONEXOVÁ) Stacionární fáze - iontoměnič, ionex mobilní fáze

IONTOVĚ VÝMĚNNÁ CHROMATOGRAFIE (IONEXOVÁ)
Stacionární fáze - iontoměnič, ionex
mobilní fáze - kapalina
Metoda

slouží k dělení látek iontové povahy - působením elektrostatických sil mezi ionty rozpuštěnými v mobilní fázi a disociovanými funkčními skupinami iontoměniče
Iontomeniče - anorganické nebo organické vysokomolekulární látky - schopny vyměňovat ionty
Důležitá konstanta - kapacita (C) - udává látkové množství iontu, které je schopen zachytit 1 ml ionexu
Katex - nerozpustná, vhodně zesíťovaná makromolekulární látka - na svém řetězci anorganická, snadno disociovatelná funkční skupina (např -SO3H)
Ve styku s vodou ? molekuly vody vyponí oka katexu ? protony se shromažďují uvnitř ok ?? voda vně ok - mizivé množství protonů, zatím co uvnitř ok je koncentrace protonů vysoká ? přidání roztoku disociované soli ? kationty Na+ do nitra katexu a vytěsní ekvivalentní množství iontů H+ , které místo nich uniknou do okolí
Anex - podobné vlastnosti jako katex, ale vyměňují anionty

9. IONEXOVÁ CHROMATOGRAFIE A GELOVÁ FILTRACE

Слайд 25

GELOVÁ CHROMATOGRAFIE Stacionární fáze- polymerní gel pravidelného prostorového uspořádání mobilní fáze

GELOVÁ CHROMATOGRAFIE
Stacionární fáze- polymerní gel pravidelného prostorového uspořádání
mobilní fáze - kapalina
Složky

se dělí na základě rozdílné velikosti molekul
látky, jejichž molekuly jsou větší než průměr pórů v gelu, nemohou do něj proniknout a postupují vpřed s mobilní fází. Menší molekuly pronikají do prostorových děr a jejich pohyb se zpomaluje
AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE
umožňuje oddělit z komplexní směsi přinejmenším omezenou skupinu příbuzných proteinů, nebo i jen jeden určitý protein
technika je založena na použití imobilizovaného ligandu (navázán na stacionární fázi) reagující specificky s enzymem, který má být očištěn
Po přidání směsi proteinů k takovémuto ligandu se na něj vážou jen ty proteiny, které s ligandem tvoří silné vazby
Zbytek směsi protéká kolonou beze změny odváděn mobilní fází.
Navázaný protein se následně euluje z imobilizovaného ligandu pomocí vysoce koncentrovaného roztoku solí nebo i roztokem s rozpustnou formou ligandu.

9. IONEXOVÁ CHROMATOGRAFIE A GELOVÁ FILTRACE

Слайд 26

35. POLYMERASOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE (PCR) Metoda rychlého a snadného zmnožení určitého

35. POLYMERASOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE (PCR)

Metoda rychlého a snadného zmnožení určitého úseku

nukleové kyseliny
Výsledkem je zmnožení izolované NK (teoreticky stačí i 1 molekula NK a mohu z ní vytvořit miliardy)
Množství kopií roste exponenciálně
SLOŽKY REAKČNÍ SMĚSI
Templát - izolovaná DNA – čím víc a čistší, tím lepší (proto předtím měřím množství a čistotu na spektrofotometru)
Primery – specifické komplementární úseky DNA (v buňkách RNA); jsou dva – každý v jednom směru polymerace DNA; umožňují nasednutí DNA polymerázy; u PCR také ohraničují úsek DNA, který chci namnožit; nesmí obsahovat vnitřně komplementární sekvence – nežádoucí tvorba „smyček“
DNA polymeráza – používá se Taq polymeráza – může fungovat při vysokých teplotách, při kterých je DNA ještě denaturována
Základní reakční roztok – obsahuje deoxynukleotidtrifosfáty, pufr, soli (vhodné iontové prostředí) a hořečnaté ionty (kofaktor polymerázy)
Слайд 27

35. POLYMERASOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE (PCR) PRINCIP 1. denaturace – zahřátí na

35. POLYMERASOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE (PCR)
PRINCIP
1. denaturace – zahřátí na 95°C; dsDNA

se rozdělí na ssDNA
2. hybridizace – dosednutí primerů (50-60°C)
3. elongace – syntéza nových řetězců (65-75°C), nukleotidy přiřazovány od primerů ve směru 5'→3'
Princip se opakuje mnohokrát (např. 30x), na konci máme spoustu kopií úseku DNA z obou stran vytyčeného specifickými primery
Слайд 28

35. POLYMERASOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE (PCR) VYUŽITÍ Využívá se např. pro sekvenování

35. POLYMERASOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE (PCR)
VYUŽITÍ
Využívá se např. pro sekvenování DNA, analýzu

genů, kvantifikace množství cílové sekvence ve vzorku (qPCR), analýza genové exprese (RT-PCR)
diagnostika infekčních onemocnění, identifikace dědičných chorob, identifikace osob – genetická daktyloskopie
Слайд 29

35. POLYMERASOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE (PCR) ELEKTROFORÉZA patří mezi separační metody izolující

35. POLYMERASOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE (PCR)
ELEKTROFORÉZA
patří mezi separační metody izolující molekuly o

rozdílné hmotnosti, popř. odlišném elektrickém náboji, využívající jejich odlišnou pohyblivost v elektrickém poli
Využití – diagnostika monogenních chorob, analýza a dělení směsí bílkovin
ELEKTROFORÉZA NUKLEOVÝCH KYSELIN
DNA namnožím pomocí PCR a nastříhám restrikčními endonukleázami (enzymy štěpící DNA ve specifickém místě – pokud je DNA mutovaná enzym není schopen DNA štěpit – vzniknou delší fragmenty – detekce mutace)
Nanesu do „vaniček“ v gelu (ty jsou poblíž katody)
Fragmenty DNA se „prodírají“ gelem směrem k anodě, menší fragmenty mají vyšší rychlost, větší naopak nižší – kratší docestují v čase dál než delší
V daném čase elektroforézu zastavím a odečtu výsledek (bandy v určité vzdálenosti) – na základě přítomnosti fragmentů o určité délce mohu potvrdit, nebo vyvrátit přítomnost jedné, nebo obou mutovaných alel dědičné choroby
Слайд 30

35. POLYMERASOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE (PCR) ELEKTROFORÉZA ELEKTROFORÉZA BÍLKOVIN V SÉRU Bílkoviny

35. POLYMERASOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE (PCR)
ELEKTROFORÉZA
ELEKTROFORÉZA BÍLKOVIN V SÉRU
Bílkoviny – amfolyty –

náboj v závislosti na pH – elektroforéza probíhá v pufru o určitém pH
Většina bílkovin – slabě kyselé (pH 5-6) – elektroforéza probíhá v alkalickém pufru (pH 8,6) – pohyb k anodě – různá rychlost
Poloha a koncentrace bílkovin v jednotlivých frakcích se následně hodnotí pomocí denzitometrie
Слайд 31

36.+37. FAKTOR V LEIDEN - MEDICÍNSKÝ VÝZNAM A DIAGNOSTIKA HEMOKOAGULACE =

36.+37. FAKTOR V LEIDEN - MEDICÍNSKÝ VÝZNAM A DIAGNOSTIKA
HEMOKOAGULACE = SRÁŽENÍ

KRVE
soubor enzymatických reakcí
výsledkem přeměna tekuté krve v nerozpustný gel
je to proces hemostázy = zástavy krvácení
Fáze hemokoagulace:
Tvorba aktivátoru protrombinu z faktoru X a V
Přeměna protrombinu na trombin
Přeměna fibrinogenu na fibrin
=>tvorba aktivátoru protrombinu limitujícím faktorem celého děje
Слайд 32

36.+37. FAKTOR V LEIDEN - MEDICÍNSKÝ VÝZNAM A DIAGNOSTIKA HEMOKOAGULAČNÍ KASKÁDA

36.+37. FAKTOR V LEIDEN - MEDICÍNSKÝ VÝZNAM A DIAGNOSTIKA

HEMOKOAGULAČNÍ KASKÁDA
Aktivátor protrombinu

vzniká vnější nebo vnitřní hemokoagulační kaskádou
Vnější: poškození cévní stěny ? uvolnění tkáňového tromboplastinu (=faktor III) ? aktivace faktoru VII ? Ca2+ a faktor VII ?aktivace faktoru X ?faktor X a faktor V vytváří aktivátor protrombinu
Vnitřní: krev + negativně nabitý nebo smáčivý povrch ? aktivace faktoru XII ? faktor XII reaguje s prekalikreinem a kininogenem ? přeměna faktoru XI na aktivní formu ? aktivovaný faktor XI a Ca2+ ionty ? aktivace faktoru IX ? aktivovaný faktor IX a VIII, destičky a Ca2+ ?aktivace faktoru X ? aktivovaný faktor X a faktor V ? vytváří aktivátor protrombinu
Слайд 33

36.+37. FAKTOR V LEIDEN - MEDICÍNSKÝ VÝZNAM A DIAGNOSTIKA LEIDENSKÁ MUTACE

36.+37. FAKTOR V LEIDEN - MEDICÍNSKÝ VÝZNAM A DIAGNOSTIKA
LEIDENSKÁ MUTACE
autosomálně dominantně

dědičná bodová mutace v genu pro hemokoagulační faktor V
Krevní srážlivost je zvýšená
Projevuje se trombofilními komplikacemi, nejčastěji trombózami žil s rizikem následné plicní embolie
Záměna nukleotidu guaninu za adenin ? substituce argininu za glutamin ? odolnost faktoru V vůči proteinu C, který ho má degradovat ? nedochází k inhibici hemokoagulační kaskády
K léčení trombofilních stavů se používají kumarinové deriváty (warfarin = antivitamin K) a heparin
Слайд 34

36.+37. FAKTOR V LEIDEN - MEDICÍNSKÝ VÝZNAM A DIAGNOSTIKA LABORATORNÍ TESTOVÁNÍ

36.+37. FAKTOR V LEIDEN - MEDICÍNSKÝ VÝZNAM A DIAGNOSTIKA
LABORATORNÍ TESTOVÁNÍ HEMOKOAGULACE
Testování

vnějšího systému:
protrombinovým časem = doba, za kterou se v plazmě vytvoří fibrinové vlákno po přidání vápenatých iontů a tromboplastinu (neměl by být delší než 11-13 sekund)
INR- normalizovaný poměr naměřené hodnoty času u pacienta a času u normální plazmy, ideálně jedna
Používá se k sledování kumarinové terapie
Testování vnitřního systému:
aktivovaným parciálním tromboplastinovým časem (aPTT) = doba (fyziologicky 25,9-40s), za kterou se ve sledované plazmě vytvoří fibrinové vlákno po spuštění koagulační kaskády směsí látek aktivujících faktor XII (kaolin-kefalinový komplex nahrazuje negativitu kolagenu, který ji spouští in vivo)
Používá se k sledování heparinové terapie
Poměr k normální plazmě 0,83-1,3
Prodloužení doby – hrozí krvácení; zkrácení doby - nebezpečí vzniku trombů
- Предыдущая
Текст. Стили речи. Типы речи
Следующая -
Фонетика, графика, орфография, лексика

Похожие презентации

Углеводы. Карбоновые кислоты и их производные
Урок химии в 9-ом классе Тема урока "Сера"
Пространственное строение органических соединений. (Лекция 2)
Особенности химического состава клетки
Каркасные силикаты
Обмен белков и аминокислот. Азотистый баланс. (Лекция 14)
IVA группа С, Si, Ge, Sn, Pb (подгруппа титана)
Минерал как химическое соединение
Тест по неорганической химии
Никель Ni
солі в природі Солі препарати замінення атомів водної кислоти
Камень, скользящий на льду
Defect in solid
Элемент № 24 периодической таблицы. Хром
Химическая термодинамика и биоэнергетика. Второй закон термодинамики
КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ КАФЕДРА ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ И КЛИНИЧЕСКОЙ БИОХИМИИ Лекция по теме: «Матричные б
Основные классы неорганических и органических соединений
Реакция обменного разложения веществ водой - гидролиз
Ресурсы и энергоснабжение
Газообразное состояние вещества
Презентация по Химии "Алюминий (11 класс)" - скачать смотреть
Типы изомерии 1.Историческая справка 2.Изомерия. Изомеры. 3.Типы изомерии. Классификация изомеров.
Органическая химия и важнейшие органические соединения углевода
Состав, структура, свойства ДНК. (Лекция 2)
Логическая структура модуля по дисциплине "Аналитическая химия"
Мило
Роль микро- и макроэлементов в здоровье человека
Кремний и его «родственники»
Вы можете прислать нам Вашу презентацию и мы опубликуем ее на сайте.
Обратная связь
Для правообладателей
Email: Нажмите что бы посмотреть