Иммунноферментный анализ (ИФА). Иммуноблотинг. Иммунохроматографический метод

Август 22, 2022

Главная
Медицина
Иммунноферментный анализ (ИФА). Иммуноблотинг. Иммунохроматографический метод

Содержание

2. Контрольные вопросы: 1. Иммуноферментный анализ: назначение (области применения, выявляемые вещества), механизм реакции, способы постановки ИФА; необходимые
3. На занятие принести перчатки
4. Метод иммунноферментного анализа (ИФА)
5. Метод ИФА – высокочувствительный и высокоспецифичный иммунодиагностический метод, с помощью которого проводят качественное и количественное определение
6. Метод ИФА используется: для диагностики инфекционных заболеваний для диагностики неинфекционных заболеваний человека и животных подтверждения качества
7. Метод ИФА Гетерогенный ИФА – ТВЕРДОФАЗНЫЙ Гомогенный ИФА Антиген или антитело сорбировано в полистироловом планшете Все
9. Твердофазный ИФА неконкурентный ИФА конкурентный ИФА Вариант непрямого неконкурентного ИФА – метод «сэндвича»
10. Иммуноферментный анализ – выявление антигенов или антител с помощью соответствующих им антител (антигенов), конъюгированных с ферментом-меткой
11. Оборудование и принадлежности для проведения метода ИФА Для проведения твердофазного ИФА используются разборные и неразборные 96-луночные
13. Иммуноферментный планшетный фотометр
14. Детекция результатов метода ИФА
15. Конкурентный метод ИФА 1- исследуемый антиген 3- антитело известное 2- известный меченный антиген
16. Этапы конкурентного ИФА На твердой фазе иммобилизируют специфические для выявляемого антигена моноклональные антитела В лунки вносят
17. АНТИГЛОБУЛИНОВЫЕ АНТИТЕЛА, КОНЪЮГИРОВАННЫЕ С ФЕРМЕНТНОЙ МЕТКОЙ ИССЛЕДУЕМАЯ СЫВОРОТКА ЛУНКА С НАНЕСЕННЫМИ АНТИГЕНАМИ отмывка отмывка СУБСТРАТ К
18. Этапы неконкурентного ИФА К иммобилизованным на поверхность лунки антигенам добавляют исследуемый материал – сыворотку крови, инкубируют.
19. Неконкурентный ИФА. Метод «сэндвича» ЛУНКА С ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ АНТИТЕЛАМИ ИССЛЕДУЕМАЯ СЫВОРОТКА КОНЪЮГАТ: ПОЛИКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА, МЕЧЕННЫЕ ФЕРМЕНТОМ ИНКУБАЦИЯ,
20. Инструкция для постановки ИФА, метод «сэндвича», для определения HBs-антигена вируса гепатита В Набор «Вектогеп В –
21. Проведение анализа 1. Внести в лунку А1 50 мкл К– 2. Внести в лунку В1 50
22. Регистрация результатов Результаты ИФА регистрировать с помощью спектрофотометра. Учет результатов реакции Значения ОП К– ≤ 0,10
23. Иммуноблоттинг - Иммуноблоттинг (вестерн-блот, белковый иммуноблот, англ. Western blot) – аналитический метод, используемый для определения в
24. Механизм иммуноблоттинга
25. Иммуноблоттинг. Определение Ig G к вирусам герпеса 1 и 2 типов
26. ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
27. Иммунохроматографический анализ (ИХА) – это иммунохимическимй метод, основанный на принципе тонкослойной хроматографии и включающий реакцию между
28. Тест-полоска (рис. 1) представляет собой мультимембранный композит («сэндвич»), который состоит из: 1.Подложки, адсорбирующей образец, на которую
29. Рисунок 1. Структура тест-полоски
30. Выявление антигена SARS-CoV-2 в мазках из носоглотки и ротоглотки человека иммунохроматографическим методом Пример состава набора для
31. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА: 1. Подготовка образцов - Взять мазки со слизистой носоглотки и ротоглотки палочками-тампонами. - Поместить
32. 2. Ход реакции (Рис. 2): Если в анализируемой пробе есть антиген вируса SARS-CoV-2, попав на тест-полоску,
33. Дойдя до аналитической зоны Т, он связывается с иммобилизованными специфическими антителами против SARS-CoV-2, происходит формирование окрашенного
34. 3. Интерпретация результатов Выявление в тестовом окошке кассеты одной красной контрольной линии (С) свидетельствует об отрицательном
35. Иммунохроматографический анализ Ссылка на видео-файл «Проведение ИХА» https://www.youtube.com/watch?v=A00tl8SwES4&t=84s&ab_channel=SHOPRASEIA
36. ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ
37. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов
38. 1953 открытие двойной спирали ДНК (Уотсон и Крик) изобретение ПЦР (Кэри Маллис) 1993 за изобретение ПЦР
39. 1. Пробоподготовка 2. Амплификация Этапы классического ПЦР-анализа 3. Детекция результатов
40. Пробоподготовка – выделение нуклеиновых кислот ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ: лизис изоляция НК освобождение от ингибиторов элюция (переведение НК
41. Минимальный состав смеси для ПЦР ДНК-матрица олигонуклеотидные праймеры cмесь dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) полимераза буферный
42. Этапы ПЦР Денатурация ДНК (~ 950 C) Отжиг (гибридизация) праймеров на ДНК (~ 550 C) Синтез
43. ДНК праймер или зонд (синтетический фрагмент ДНК) соответствующий участок матрицы (мишени) праймеры – короткие синтетические молекулы
44. праймер соответствующий участок матрицы (мишени) Фермент ПЦР –Taq полимераза (выделена из бактерии Thermus aquaticus) термостабильна -
45. Удлинение цепей ДНК-полимеразой Продукт ПЦР – двухцепочечный специфический фрагмент ДНК (ампликон)
46. денатурация (плавление двуцепочечной ДНК-матрицы) 10 сек – 2 мин Стандартный температурный режим одного цикла отжиг (гибридизация
48. Дополнительная стадия для РНК-содержащих возбудителей кДНК РНК праймер далее ПЦР по описанной выше схеме ОТ-ПЦР –
49. По конечной точке (после окончания реакции) В реальном времени (после каждого цикла) FLASH Электрофорез Реал-тайм Детекция
50. Детекция электрофорезом
51. Детекция электрофорезом Разделение фрагментов ДНК (ампликонов) в геле в соответствии с их зарядом и линейными размерами
52. В флуоресцентных методах детекции используют интеркалирующие красители либо флуорофоры в составе ДНК-зондов. Интеркалирующие красители – молекулы,
53. Детекция в формате FLASH Вариант детекции «по конечной точке» Аналитический сигнал – прирост флуоресценции после окончания
54. Детекция продуктов ПЦР в режиме реального времени Технология TaqMan
55. «Пороговый цикл» Ct «Фон» «Порог» «Пороговый цикл» Результаты анализа интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения
56. Наименьшее количество НК Наибольшее количество НК Чем больше значение Ct, тем меньше концентрация исходной НК
57. Анализируемый образец считается положительным т.е содержащим, например, РНК SARS-Cov-2, если для этого образца значение порогового цикла
58. Низкое значение порогового цикла указывает на высокий уровень вируса, которому сопутствует более высокая инфекционность. Высокое значение
59. Полимеразная цепная реакция. Определение РНК SARS-CoV-2
60. Полимеразная цепная реакция. Определение РНК SARS-CoV-2
61. Полимеразная цепная реакция. Определение РНК SARS-CoV-2
62. АМПЛИФИКАТОРЫ Stratagene Mx3005P One Step Plus CFX 96 iQ 5 АНК-32 SmartCycler II Cobas TaqMan ДТ-96
63. АВТОМАТИЧЕСКАЯ СТАНЦИЯ Tecan Freedom EVO TECAN Freedom EVO 150, 8 каналов дозирования
64. Протокол. Метод иммуноферментного анализа Результат ИФА ОПкрит = ОП К– + 0,04 ОПкрит = Результат положительный:
66. Скачать презентацию

Слайд 2

Контрольные вопросы:
1. Иммуноферментный анализ: назначение (области применения, выявляемые вещества), механизм реакции,

способы постановки ИФА; необходимые принадлежности и оборудование.
2.Необходимые ингредиенты, особенности и схема постановки неконкурентного ИФА методом «сэндвича».
3. Иммуноблоттинг: сущность метода, особенности проведения и диагностические возможности реакции.
4. Иммунохроматографический анализ (ИХА): назначение (определяемые вещества); принцип, лежащий в основе метода. Структура тест-полоски (тест-кассеты).
5. Принцип проведения ИХА: исследуемые материалы, их подготовка, выполнение исследования, интерпретация результатов. Диагностические возможности ИХА.
6. Полимеразная цепная реакция: принцип, сущность, диагностические возможности ПЦР. Оборудование ПЦР-лаборатории.
7. Этапы ПЦР. Содержание каждого этапа. Процессы, происходящие на каждом этапе ПЦР.
8. Методы детекции результатов ПЦР, их сущность.
9. ПЦР в режиме реального времени: особенность данного варианта ПЦР. Флуоресцентный метод детекции результатов (понятие «порогового цикла», принцип учета и интерпретации результата).
ВНИМАНИЕ! Для подготовки к занятию использовать:
Презентацию к занятию
Методическую разработку «ПЦР» (на сайте в папке с презентациями).
Видеоролики по изучаемым реакциям (на сайте в СДО по теме данного занятия)

Слайд 3

На занятие принести перчатки

Слайд 4

Метод иммунноферментного анализа (ИФА)

Слайд 5

Метод ИФА –
высокочувствительный и высокоспецифичный иммунодиагностический метод, с помощью которого

проводят качественное и количественное определение различных веществ, обладающих свойствами антигена, гаптена (неполноценного антигена) или антитела.

Слайд 6

Метод ИФА используется:
для диагностики инфекционных заболеваний
для диагностики неинфекционных заболеваний человека

и животных
подтверждения качества иммунобиологических лекарственных препаратов (ИЛП)

Слайд 7

Метод ИФА
Гетерогенный ИФА
– ТВЕРДОФАЗНЫЙ
Гомогенный ИФА
Антиген или антитело сорбировано
в

полистироловом планшете

Все компоненты находятся в жидкости. В настоящее время пратически не используется

Слайд 8

Слайд 9

Твердофазный ИФА
неконкурентный ИФА
конкурентный ИФА
Вариант непрямого неконкурентного ИФА – метод

«сэндвича»

Слайд 10

Иммуноферментный анализ
– выявление антигенов или антител с помощью соответствующих им

антител (антигенов), конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, бета-галактозидазой или щелочной фосфатазой).
После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат-хромоген.
Субстрат расщепляется ферментом, это приводит к изменению цвета продукта реакции: интенсивность окраски пропорциональна количеству иммунных комплексов (детекция результатов осуществляется с помощью спектрофотометра).

Слайд 11

Оборудование и принадлежности для проведения метода ИФА
Для проведения твердофазного

ИФА используются разборные и неразборные 96-луночные планшеты

Дозатор
многоканальный

Слайд 12

Слайд 13

Иммуноферментный планшетный фотометр

Слайд 14

Детекция результатов метода ИФА

Слайд 15

Конкурентный метод ИФА
1- исследуемый
антиген
3- антитело
известное
2- известный
меченный
антиген

Слайд 16

Этапы конкурентного ИФА
На твердой фазе иммобилизируют специфические для выявляемого антигена моноклональные

антитела
В лунки вносят в известной концентации антиген, меченный ферментом, и исследуемый образец. Искомый антиген и меченный ферментом антиген конкурируют друг с другом за связывание иммобилизованных антител. Проводят инкубацию и отмывку.
Далее в лунку добавляется субстрат-хромоген реагент, который превращается в окрашенный продукт под влиянием ферментного компонента конъюгата, после чего происходит детекция и интерпретация результатов
Интенсивность окраски обратно пропорциональна количеству связавшихся молекул искомого антигена с антителами

Слайд 17

АНТИГЛОБУЛИНОВЫЕ
АНТИТЕЛА, КОНЪЮГИРОВАННЫЕ С ФЕРМЕНТНОЙ МЕТКОЙ
ИССЛЕДУЕМАЯ
СЫВОРОТКА
ЛУНКА
С НАНЕСЕННЫМИ
АНТИГЕНАМИ
отмывка
отмывка
СУБСТРАТ
К ФЕРМЕНТУ
«стоп реагент»
+
Неконкурентный метод

ИФА

шейкер

Слайд 18

Этапы неконкурентного ИФА
К иммобилизованным на поверхность лунки антигенам добавляют исследуемый материал

– сыворотку крови, инкубируют. Исследуемые антитела из сыворотки связываются с антигеном и таким образом иммобилизируются на поверхности лунки. Несвязавшиеся антитела удаляют отмыванием.
В лунку вносят конъюгат, то есть антиглобулиновое антитело, меченное ферментом, инкубируют. Если в ячейке имеются образовавшиеся на первой стадии иммунные комплексы, то конъюгат соединяется с ними во время второй инкубации, а несвязавшийся конъюгат удаляется последующим отмыванием.
Далее в лунку добавляется субстрат-хромоген реагент, который превращается в окрашенный продукт под влиянием ферментного компонента конъюгата, после чего происходит детекция и интерпретация результатов

Слайд 19

Неконкурентный ИФА. Метод «сэндвича»
ЛУНКА С ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ АНТИТЕЛАМИ
ИССЛЕДУЕМАЯ СЫВОРОТКА
КОНЪЮГАТ:
ПОЛИКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА, МЕЧЕННЫЕ ФЕРМЕНТОМ
ИНКУБАЦИЯ,

ОТМЫВКА

СУБСТРАТ К ФЕРМЕНТУ

СТОП-РЕАГЕНТ

ИНКУБАЦИЯ В ТЕМНОТЕ

Слайд 20

Инструкция для постановки ИФА, метод «сэндвича», для определения HBs-антигена вируса гепатита

Набор «Вектогеп В – HBs-антиген» предназначен для иммуноферментного выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) в сыворотке (плазме) крови.
Принцип действия
Принцип метода заключается во взаимодействии HBsAg с моноклональными антителами, иммобилизованными на поверхности лунок полистиролового планшета. Комплекс «антиген-антитело» выявляют с помощью конъюгата поликлональных антител с пероксидазой хрена.
Состав набора:
планшет с иммобилизованными моноклональными антителами к HBsAg
положительный контрольный образец (К+), инактивированный, содержит (4,0±2,0) МЕ/мл HBsAg
отрицательный контрольный образец (К–), инактивированный
конъюгат – поликлональные антитела к HBsAg, меченые пероксидазой хрена
субстрат-хромоген – тетраметилбензидин (ТМБ)
буферный раствор (БР)
стоп-реагент

Слайд 21

Проведение анализа
1. Внести в лунку А1 50 мкл К–
2. Внести в лунку В1

50 мкл К+
3. В остальные лунки (C1-H1) внести по 50 мкл исследуемых образцов, меняя наконечники для каждой лунки.
4. Во все лунки (A1-H1) внести по 50 мкл раствора конъюгата, не меняя наконечник.
5. Планшет инкубировать 37°С 20 мин.
6. По окончании инкубации содержимое лунок собрать пипеткой в сосуд с дезинфицирующим раствором, меняя наконечники для каждой лунки.
7. Промыть лунки 1 раз буферным раствором пипеткой объемом 50 мкл, меняя наконечники для каждой лунки.
8. Внести во все лунки по 50 мкл раствора субстрата-хромогена (ТМБ), не меняя наконечник.
9. Планшет поместить в защищённое от прямого солнечного света место при температуре (18−25)°С на 20 минут.
10. Остановить реакцию добавлением во все лунки по 50 мкл стоп-реагента, не меняя наконечник, и через 2−3 минуты измерить оптическую плотность (ОП).

Слайд 22

Регистрация результатов
Результаты ИФА регистрировать с помощью спектрофотометра.
Учет результатов реакции
Значения ОП К–

≤ 0,10 ед.опт.пл
Значение ОП К+ ≥ 1,0 ед. опт. пл
Вычислить критический уровень ОП (ОПкрит) по формуле: ОПкрит = ОП К– + 0,04
Интерпретация результатов
Результат анализа считать положительным, если ОПобр ≥ ОПкрит
Результат анализа считать отрицательным, если ОПобр < ОПкрит, где ОПобр – ОП в лунке с анализируемым образцом.
Положительный результат означает, что тестируемый образец содержит HBsAg
Отрицательными считать образцы, имеющие ОП меньше ОПкрит.
Отрицательный результат указывает, что тестируемый образец не содержит HBsAg или содержит HBsAg в концентрации ниже определяемого набором реагентов уровня.

Слайд 23

Иммуноблоттинг -
Иммуноблоттинг (вестерн-блот, белковый иммуноблот, англ. Western blot) – аналитический метод, используемый

для определения в образце специфичных белков. На первом этапе используют электрофорез в полиакриламидном геле для разделения денатурированных полипептидов по длине или по трехмерной структуре белка. Далее белки переносят на нитроцеллюлозную или фторопластовую мембрану, затем детектируют с использованием антител, специфичных к искомому белку.

Слайд 24

Механизм иммуноблоттинга

Слайд 25

Иммуноблоттинг. Определение Ig G к вирусам герпеса 1 и 2 типов

Слайд 26

ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

Слайд 27

Иммунохроматографический анализ (ИХА) – это иммунохимическимй метод, основанный на принципе тонкослойной

хроматографии и включающий реакцию между антигеном и соответствующим ему антителом, для определения наличия низких концентраций веществ в биологических материалах (моча, цельная кровь, сыворотка или плазма крови, слюна, фекалии и т. д.). Метод отличается высокой степенью чувствительности и специфичности.
Метод позволяет визуально в течение нескольких минут определить и оценить содержание антигенов, антител, гормонов и других диагностически важных веществ в организме человека.
Данный вид анализа осуществляется при помощи тест-полосок, палочек, панелей или тест-кассет, которые обеспечивают быстроту проведения тестирования. Принцип их работы основан на движении биологической жидкости вдоль мембран иммунохроматографической тест-полоски под действием капиллярных сил, что приводит к последовательному взаимодействию реагентов на разных участках мембран. В результате такого взаимодействия появляется окрашивание определенных участков тест-полоски.

Слайд 28

Тест-полоска (рис. 1) представляет собой мультимембранный композит («сэндвич»), который состоит из:

1.Подложки, адсорбирующей образец, на которую наносится анализируемая проба (кровь, сыворотка крови, смыв из носа и др.);
2.Подложки под конъюгат – на нее нанесены «первые» антитела (моноклональные) к выявляемому антигену, которые конъюгированы с маркером (коллоидным золотом, окрашенными шариками латекса и др.);
3.Рабочей мембраны с двумя участками – в ее тестовой зоне (Т-зона) нанесены «вторые» антитела (поликлональные) к выявляемому антигену, в контрольной зоне (С-зона) нанесены антивидовые антитела к «первым» антителам.
4.Конечной адсорбирующей подложки, впитывающей жидкость, протекающую через рабочую мембрану.

Слайд 29

Рисунок 1. Структура тест-полоски

Слайд 30

Выявление антигена SARS-CoV-2 в мазках из носоглотки и ротоглотки человека иммунохроматографическим

методом
Пример состава набора для проведения ИХА

Слайд 31

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА:
1. Подготовка образцов
- Взять мазки со слизистой носоглотки

и ротоглотки палочками-тампонами.

- Поместить палочку-тампон с образцом во флакон-капельницу с буферным раствором. Смыть образец с палочки-тампона в раствор.
- Внести 3 капли в круглое окошко кассеты.

Слайд 32

2. Ход реакции (Рис. 2):
Если в анализируемой пробе есть антиген вируса

SARS-CoV-2, попав на тест-полоску, он вступает в реакцию со специфическими антителами против SARS-CoV-2, конъюгированными с окрашенным маркером. Образуется комплекс, который под действием капиллярных сил перемещается дальше вдоль тест-полоски (а).

Рисунок 2. Механизм ИХА

Слайд 33

Дойдя до аналитической зоны Т, он связывается с иммобилизованными специфическими антителами

против SARS-CoV-2, происходит формирование окрашенного сэндвич-комплекса (б): иммобилизованные антитела–нуклеокапсидный антиген образца–коньюгат антител с маркером и образование видимой глазом окрашенной полосы в аналитической зоне тест-полоски. Следуя далее по мембране теста, не связавшийся в Т-зоне коньюгат антител с маркером доходит до контрольной С-зоны, где обязательно связывается с антиглобулиновыми антителами независимо от наличия или отсутствия антигена вируса в пробе (в). Эта реакция приводит к образованию контрольной окрашенной линии.

Слайд 34

3. Интерпретация результатов
Выявление в тестовом окошке кассеты одной красной контрольной

линии (С) свидетельствует об отрицательном результате анализа, т.е. указывает на отсутствие в анализируемом образце мазка со слизистой из носоглотки и/или ротоглотки нуклеокапсидного антигена вируса SARS-CoV-2 (рис.3.1).
Выявление в тестовом окошке кассеты двух параллельных линий (Т и С) свидетельствует о положительном результате анализа, т.е. указывает на наличие в анализируемом образце антигена вируса SARS-CoV-2 (рис.3.2). В тех случаях, когда в тестовом окне тест-кассеты не образуется контрольной линии С или линия только в зоне Т, результат анализа признается недостоверным (рис. 3.3). В этом случае анализ следует повторить с использованием другой тест-кассеты.
3.1 3.2 3.3

Рисунок 3. Интерпретация результатов ИХА

Слайд 35

Иммунохроматографический анализ
Ссылка на видео-файл «Проведение ИХА»
https://www.youtube.com/watch?v=A00tl8SwES4&t=84s&ab_channel=SHOPRASEIA

Слайд 36

ПОЛИМЕРАЗНАЯ
ЦЕПНАЯ
РЕАКЦИЯ

Слайд 37

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций

определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

ПЦР – гибридизационный метод, основанный на
принципе комплементарности

Слайд 38

1953 открытие двойной спирали ДНК (Уотсон и Крик)
изобретение ПЦР (Кэри Маллис)
1993 за

изобретение ПЦР Кэри Маллису вручена нобелевская премия по химии
1993 изобретение ПЦР в реальном времени

Слайд 39

1. Пробоподготовка
2. Амплификация
Этапы классического ПЦР-анализа
3. Детекция результатов

Слайд 40

Пробоподготовка – выделение нуклеиновых кислот
ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ:
лизис
изоляция НК
освобождение от ингибиторов
элюция

(переведение НК в раствор)

Основные задачи

Максимальный выход НК
Удаление ингибиторов ПЦР
Удаление или ингибирование нуклеаз
Очистка НК

Слайд 41

Минимальный состав смеси для ПЦР
ДНК-матрица
олигонуклеотидные праймеры
cмесь dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP)
полимераза
буферный

раствор, содержащий ионы Mg2+

Слайд 42

Этапы ПЦР
Денатурация ДНК (~ 950 C)
Отжиг (гибридизация) праймеров на ДНК

(~ 550 C)
Синтез фрагмента ДНК (элонгация) с помощью
термостабильной ДНК-полимеразы (~ 720 C)

Реакция повторяется 30-50 циклов, количество специфического фрагмента ДНК возрастает в 1-10 млн. раз

Амплификация – увеличение количества ампликонов в ходе многократно (обычно 30-50 раз) повторяющихся циклов (раундов) денатурации, гибридизации и удлинения цепей

Слайд 43

ДНК
праймер или зонд (синтетический фрагмент ДНК)
соответствующий участок матрицы (мишени)
праймеры – короткие

синтетические молекулы ДНК, ограничивающие синтезируемый фрагмент;
гибридизация – образование комплекса праймера и матрицы:
возможна при разделении нитей ДНК

Слайд 44

праймер
соответствующий участок матрицы (мишени)
Фермент ПЦР –Taq полимераза (выделена из бактерии Thermus

aquaticus) термостабильна - может выдерживать длительное нагревание при 950С и многократную смену температуры с сохранением активности

произошла денатурация (расхождение) цепей двухцепочечной ДНК и гибридизация участка каждой из цепей с комплементарным ему праймером

Слайд 45

Удлинение цепей ДНК-полимеразой
Продукт ПЦР – двухцепочечный специфический фрагмент ДНК (ампликон)

Слайд 46

денатурация (плавление двуцепочечной ДНК-матрицы)
10 сек – 2 мин
Стандартный температурный режим одного

цикла

отжиг (гибридизация праймера и одноцепочечной матрицы)
10-40 сек

элонгация (удлинение праймера на матрице полимеразой и образование новой копии двуцепочечной ДНК)
15 сек – 2 мин

Слайд 47

Слайд 48

Дополнительная стадия для РНК-содержащих возбудителей
кДНК
РНК
праймер
далее ПЦР по описанной выше схеме
ОТ-ПЦР –

полимеразная цепная реакция с предшествующей ей стадией обратной транскрипции

Обратная транскрипция и ПЦР
РНК не может быть матрицей для ПЦР!

Фермент – обратная
транскриптаза (ревертаза)

Слайд 49

По конечной точке
(после окончания реакции)
В реальном времени
(после каждого цикла)
FLASH
Электрофорез
Реал-тайм

Детекция результатов

Слайд 50

Детекция электрофорезом

Слайд 51

Детекция электрофорезом
Разделение фрагментов ДНК (ампликонов) в геле в соответствии с их

зарядом и линейными размерами

S10

S11

S12

Слайд 52

В флуоресцентных методах детекции используют интеркалирующие красители либо флуорофоры в составе

ДНК-зондов. Интеркалирующие красители – молекулы, способные обратимо встраиваться между двумя комплементарными парами нуклеотидов в двуспиральной ДНК.

Детекция осуществляется специальными приборами после амплификации (ПЦР с анализом результатов по конечной точке) либо в процессе амплификации (ПЦР в режиме реального времени).

Слайд 53

Детекция в формате FLASH
Вариант детекции «по конечной точке»
Аналитический сигнал – прирост

флуоресценции после окончания реакции

Слайд 54

Детекция продуктов ПЦР в режиме реального времени
Технология TaqMan

Слайд 55

«Пороговый цикл» Ct
«Фон»
«Порог»
«Пороговый цикл»
Результаты анализа интерпретируются на основании наличия

(или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что определяет наличие (или отсутствие) значения порогового цикла Ct, на котором происходит это пересечение.

Слайд 56

Наименьшее количество НК
Наибольшее количество НК
Чем больше значение Ct, тем меньше концентрация

исходной НК

Слайд 57

Анализируемый образец считается положительным т.е содержащим, например, РНК SARS-Cov-2, если для

этого образца значение порогового цикла меньше или равно 40.
Анализируемый образец считается отрицательным т.е не содержащим, например, РНК SARS-Cov-2, если для этого образца значение порогового цикла больше 40 или не определяется.

Слайд 58

Низкое значение порогового цикла указывает на высокий уровень вируса, которому сопутствует

более высокая инфекционность.
Высокое значение порогового цикла указывает на низкий уровень вируса в исследуемом материале, что может свидетельствовать о следующем:
• начало инфекционной фазы, когда количество вируса ещё чётко не определяется и человек потенциально уже может заразить окружающих;
• фаза выздоровления (завершения инфекции), если человек до недавнего времени был инфицирован, но на текущий момент риск заражения окружающих уже может быть сниженным.

Слайд 59

Полимеразная цепная реакция. Определение РНК SARS-CoV-2

Слайд 60

Полимеразная цепная реакция. Определение РНК SARS-CoV-2

Слайд 61

Полимеразная цепная реакция. Определение РНК SARS-CoV-2

Слайд 62

АМПЛИФИКАТОРЫ
Stratagene Mx3005P
One Step Plus
CFX 96
iQ 5
АНК-32
SmartCycler II
Cobas TaqMan
ДТ-96
Rotorgene 6000

Слайд 63

АВТОМАТИЧЕСКАЯ СТАНЦИЯ
Tecan Freedom EVO
TECAN Freedom EVO 150, 8 каналов

дозирования

Слайд 64

Протокол. Метод иммуноферментного анализа
Результат ИФА
ОПкрит = ОП К– + 0,04
ОПкрит

Результат положительный: ОПобр ≥ ОПкрит
Результат отрицательный:
ОПобр < ОПкрит

Иммунноферментный анализ (ИФА). Иммуноблотинг. Иммунохроматографический метод

Содержание

Контрольные вопросы:1. Иммуноферментный анализ: назначение (области применения, выявляемые вещества), механизм реакции,

На занятие принести перчатки

Метод иммунноферментного анализа (ИФА)

Метод ИФА – высокочувствительный и высокоспецифичный иммунодиагностический метод, с помощью которого

Метод ИФА используется: для диагностики инфекционных заболеванийдля диагностики неинфекционных заболеваний человека

Метод ИФА Гетерогенный ИФА– ТВЕРДОФАЗНЫЙ Гомогенный ИФААнтиген или антитело сорбировано в

Твердофазный ИФА неконкурентный ИФА конкурентный ИФАВариант непрямого неконкурентного ИФА – метод

Иммуноферментный анализ – выявление антигенов или антител с помощью соответствующих им

Оборудование и принадлежности для проведения метода ИФА Для проведения твердофазного

Иммуноферментный планшетный фотометр

Детекция результатов метода ИФА

Конкурентный метод ИФА1- исследуемый антиген3- антитело известное 2- известный меченный антиген

Этапы конкурентного ИФАНа твердой фазе иммобилизируют специфические для выявляемого антигена моноклональные

Этапы неконкурентного ИФАК иммобилизованным на поверхность лунки антигенам добавляют исследуемый материал

Неконкурентный ИФА. Метод «сэндвича»ЛУНКА С ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ АНТИТЕЛАМИИССЛЕДУЕМАЯ СЫВОРОТКАКОНЪЮГАТ:ПОЛИКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА, МЕЧЕННЫЕ ФЕРМЕНТОМИНКУБАЦИЯ,

Инструкция для постановки ИФА, метод «сэндвича», для определения HBs-антигена вируса гепатита

Проведение анализа 1. Внести в лунку А1 50 мкл К–2. Внести в лунку В1

Регистрация результатовРезультаты ИФА регистрировать с помощью спектрофотометра.Учет результатов реакцииЗначения ОП К–

Иммуноблоттинг - Иммуноблоттинг (вестерн-блот, белковый иммуноблот, англ. Western blot) – аналитический метод, используемый

Механизм иммуноблоттинга

Иммуноблоттинг. Определение Ig G к вирусам герпеса 1 и 2 типов

ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

Иммунохроматографический анализ (ИХА) – это иммунохимическимй метод, основанный на принципе тонкослойной

Тест-полоска (рис. 1) представляет собой мультимембранный композит («сэндвич»), который состоит из:

Рисунок 1. Структура тест-полоски

Выявление антигена SARS-CoV-2 в мазках из носоглотки и ротоглотки человека иммунохроматографическим

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА: 1. Подготовка образцов - Взять мазки со слизистой носоглотки

2. Ход реакции (Рис. 2):Если в анализируемой пробе есть антиген вируса

Дойдя до аналитической зоны Т, он связывается с иммобилизованными специфическими антителами

3. Интерпретация результатов Выявление в тестовом окошке кассеты одной красной контрольной

Иммунохроматографический анализСсылка на видео-файл «Проведение ИХА»https://www.youtube.com/watch?v=A00tl8SwES4&t=84s&ab_channel=SHOPRASEIA

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций

1953 открытие двойной спирали ДНК (Уотсон и Крик) изобретение ПЦР (Кэри Маллис)1993 за

1. Пробоподготовка 2. Амплификация Этапы классического ПЦР-анализа3. Детекция результатов

Пробоподготовка – выделение нуклеиновых кислотОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ:лизис изоляция НК освобождение от ингибиторовэлюция

Минимальный состав смеси для ПЦРДНК-матрицаолигонуклеотидные праймерыcмесь dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP)полимеразабуферный

Этапы ПЦР Денатурация ДНК (~ 950 C)Отжиг (гибридизация) праймеров на ДНК

ДНКпраймер или зонд (синтетический фрагмент ДНК)соответствующий участок матрицы (мишени)праймеры – короткие

праймерсоответствующий участок матрицы (мишени)Фермент ПЦР –Taq полимераза (выделена из бактерии Thermus

Удлинение цепей ДНК-полимеразой Продукт ПЦР – двухцепочечный специфический фрагмент ДНК (ампликон)

денатурация (плавление двуцепочечной ДНК-матрицы)10 сек – 2 минСтандартный температурный режим одного

Дополнительная стадия для РНК-содержащих возбудителейкДНКРНКпраймердалее ПЦР по описанной выше схемеОТ-ПЦР –

По конечной точке (после окончания реакции)В реальном времени(после каждого цикла)FLASHЭлектрофорезРеал-тайм

Детекция электрофорезом

Детекция электрофорезомРазделение фрагментов ДНК (ампликонов) в геле в соответствии с их

В флуоресцентных методах детекции используют интеркалирующие красители либо флуорофоры в составе

Детекция в формате FLASHВариант детекции «по конечной точке»Аналитический сигнал – прирост

Детекция продуктов ПЦР в режиме реального времениТехнология TaqMan

«Пороговый цикл» Ct «Фон»«Порог»«Пороговый цикл» Результаты анализа интерпретируются на основании наличия

Наименьшее количество НКНаибольшее количество НКЧем больше значение Ct, тем меньше концентрация

Анализируемый образец считается положительным т.е содержащим, например, РНК SARS-Cov-2, если для

Низкое значение порогового цикла указывает на высокий уровень вируса, которому сопутствует

Полимеразная цепная реакция. Определение РНК SARS-CoV-2

Полимеразная цепная реакция. Определение РНК SARS-CoV-2

Полимеразная цепная реакция. Определение РНК SARS-CoV-2

АМПЛИФИКАТОРЫStratagene Mx3005POne Step PlusCFX 96 iQ 5 АНК-32SmartCycler IICobas TaqManДТ-96Rotorgene 6000

АВТОМАТИЧЕСКАЯ СТАНЦИЯ Tecan Freedom EVO TECAN Freedom EVO 150, 8 каналов

Протокол. Метод иммуноферментного анализаРезультат ИФАОПкрит = ОП К– + 0,04 ОПкрит

Похожие презентации

Контрольные вопросы:
1. Иммуноферментный анализ: назначение (области применения, выявляемые вещества), механизм реакции,

Метод ИФА –
высокочувствительный и высокоспецифичный иммунодиагностический метод, с помощью которого

Метод ИФА используется:
для диагностики инфекционных заболеваний
для диагностики неинфекционных заболеваний человека

Метод ИФА
Гетерогенный ИФА
– ТВЕРДОФАЗНЫЙ
Гомогенный ИФА
Антиген или антитело сорбировано
в

Твердофазный ИФА
неконкурентный ИФА
конкурентный ИФА
Вариант непрямого неконкурентного ИФА – метод

Иммуноферментный анализ
– выявление антигенов или антител с помощью соответствующих им

Оборудование и принадлежности для проведения метода ИФА
Для проведения твердофазного

Конкурентный метод ИФА
1- исследуемый
антиген
3- антитело
известное
2- известный
меченный
антиген

Этапы конкурентного ИФА
На твердой фазе иммобилизируют специфические для выявляемого антигена моноклональные

Этапы неконкурентного ИФА
К иммобилизованным на поверхность лунки антигенам добавляют исследуемый материал

Проведение анализа
1. Внести в лунку А1 50 мкл К–
2. Внести в лунку В1

Регистрация результатов
Результаты ИФА регистрировать с помощью спектрофотометра.
Учет результатов реакции
Значения ОП К–

Иммуноблоттинг -
Иммуноблоттинг (вестерн-блот, белковый иммуноблот, англ. Western blot) – аналитический метод, используемый

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА:
1. Подготовка образцов
- Взять мазки со слизистой носоглотки

2. Ход реакции (Рис. 2):
Если в анализируемой пробе есть антиген вируса

3. Интерпретация результатов
Выявление в тестовом окошке кассеты одной красной контрольной

Иммунохроматографический анализ
Ссылка на видео-файл «Проведение ИХА»
https://www.youtube.com/watch?v=A00tl8SwES4&t=84s&ab_channel=SHOPRASEIA

ПОЛИМЕРАЗНАЯ
ЦЕПНАЯ
РЕАКЦИЯ

1953 открытие двойной спирали ДНК (Уотсон и Крик)
изобретение ПЦР (Кэри Маллис)
1993 за

1. Пробоподготовка
2. Амплификация
Этапы классического ПЦР-анализа
3. Детекция результатов

Пробоподготовка – выделение нуклеиновых кислот
ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ:
лизис
изоляция НК
освобождение от ингибиторов
элюция

Минимальный состав смеси для ПЦР
ДНК-матрица
олигонуклеотидные праймеры
cмесь dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP)
полимераза
буферный

Этапы ПЦР
Денатурация ДНК (~ 950 C)
Отжиг (гибридизация) праймеров на ДНК

ДНК
праймер или зонд (синтетический фрагмент ДНК)
соответствующий участок матрицы (мишени)
праймеры – короткие

праймер
соответствующий участок матрицы (мишени)
Фермент ПЦР –Taq полимераза (выделена из бактерии Thermus

Удлинение цепей ДНК-полимеразой
Продукт ПЦР – двухцепочечный специфический фрагмент ДНК (ампликон)

денатурация (плавление двуцепочечной ДНК-матрицы)
10 сек – 2 мин
Стандартный температурный режим одного

Дополнительная стадия для РНК-содержащих возбудителей
кДНК
РНК
праймер
далее ПЦР по описанной выше схеме
ОТ-ПЦР –

По конечной точке
(после окончания реакции)
В реальном времени
(после каждого цикла)
FLASH
Электрофорез
Реал-тайм

Детекция электрофорезом
Разделение фрагментов ДНК (ампликонов) в геле в соответствии с их

Детекция в формате FLASH
Вариант детекции «по конечной точке»
Аналитический сигнал – прирост

Детекция продуктов ПЦР в режиме реального времени
Технология TaqMan

«Пороговый цикл» Ct
«Фон»
«Порог»
«Пороговый цикл»
Результаты анализа интерпретируются на основании наличия

Наименьшее количество НК
Наибольшее количество НК
Чем больше значение Ct, тем меньше концентрация

АМПЛИФИКАТОРЫ
Stratagene Mx3005P
One Step Plus
CFX 96
iQ 5
АНК-32
SmartCycler II
Cobas TaqMan
ДТ-96
Rotorgene 6000

АВТОМАТИЧЕСКАЯ СТАНЦИЯ
Tecan Freedom EVO
TECAN Freedom EVO 150, 8 каналов

Протокол. Метод иммуноферментного анализа
Результат ИФА
ОПкрит = ОП К– + 0,04
ОПкрит