Содержание
- 2. Иммуноферментный анализ (сокращённо ИФА, англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) — лабораторный иммунологический метод качественного или количественного
- 3. ИФА появился в середине 60-х годов и первоначально был разработан как метод для идентификации антигена в
- 4. Основной принцип ИФА. Для выявления антигенов. 2) Для выявления антител.
- 5. Метод основан на специфическом связывании антитела с антигеном, при этом один из компонентов коңюгирован с ферментом,
- 6. Теоретически ИФА основывается на данных современной иммунохимии и химической энзимологии, знании физико-химических закономерностей реакции антиген-антитело, а
- 7. 96 ячеечный микропланшет, используемый для постановки ИФА.
- 8. Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные стадии: 1. стадия узнавания тестируемого соединения специфическим к нему антителом,
- 9. Сущность и классификация Из-за разнообразия объектов исследования — от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, и
- 10. Примером неконкурентного формата ИФА является «сэндвич»-метод. К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген.
- 11. Среди конкурентных схем твердофазного ИФА существует два основных формата: Прямой конкурентный формат ИФА использует иммобилизованые на
- 13. В непрямом конкурентном формате ИФА используются меченные ферментом антитела (специфические или вторичные) и иммобилизованный на твердой
- 15. Если все три стадии ИФА проходят в растворе и между основными стадиями нет дополнительных этапов разделения
- 16. Для гетерогенных методов характерно проведение анализа в двухфазной системе с участием твердой фазы – носителя, и
- 17. Как любые иммунохимические методы анализа, ИФА может давать ложноположительные и ложноотрицательные результаты. Например, ложноположительные результаты при
- 18. Ферменты Ферментные метки обладают чрезвычайно мощьным каталитическим действием, одна молекула фермента может реагировать с большим количеством
- 19. Ферментные маркеры, используемые в ИФА, должны обладать следующими свойствами: – высокая активность и стабильность фермента в
- 20. Субстраты Выбор субстрата в первую очередь определяется используемым в качестве метки ферментом, так как реакция фермент-субстрат
- 21. Ферменты и их субстраты наиболее широко используемые в ИФА.
- 22. преимущества иммуноферментного анализа — высокая чувствительность, позволяющая выявлять концентрации до 0, 05 нг/мл. Такая чувствительность метода
- 23. Основные типы тест-систем в зависимости от используемых антигенов В зависимости от того, какие антигены используются, иммуноферментные
- 25. Скачать презентацию
Иммуноферментный анализ
(сокращённо ИФА, англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) — лабораторный иммунологический метод
Иммуноферментный анализ
(сокращённо ИФА, англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) — лабораторный иммунологический метод
ИФА появился в середине 60-х годов и первоначально был разработан как
ИФА появился в середине 60-х годов и первоначально был разработан как
Основной принцип ИФА.
Для выявления антигенов.
2) Для выявления антител.
Основной принцип ИФА.
Для выявления антигенов.
2) Для выявления антител.
Метод основан на специфическом связывании антитела с антигеном, при этом один
Метод основан на специфическом связывании антитела с антигеном, при этом один
Открытие возможности иммобилизации антигена и антитела на различных носителях с сохранением их связывающей активности позволило расширить использование ИФА в различных областях биологии и медицины.
Появление моноклональных антител послужило дальнейшему развитию ИФА, что позволило повысить его чувствительность, специфичность и воспроизводимость результатов.
Теоретически ИФА основывается на данных современной иммунохимии и химической энзимологии, знании
Теоретически ИФА основывается на данных современной иммунохимии и химической энзимологии, знании
[AT]+[АГ]↔[АТАГ]
Разнообразие объектов исследования от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, а также необычайно широкий круг задач, связанных с многообразием условий применения ИФА, обусловливают разработку чрезвычайно большого количество вариантов этого метода.
96 ячеечный микропланшет, используемый для постановки ИФА.
96 ячеечный микропланшет, используемый для постановки ИФА.
Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные стадии:
1. стадия узнавания тестируемого соединения
Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные стадии:
1. стадия узнавания тестируемого соединения
2. стадия формирования связи коңюгата с иммунным комплексом или со свободными местами связывания;
3. стадия превращения ферментной метки в регистрируемый сигнал.
Сущность и классификация
Из-за разнообразия объектов исследования — от низкомолекулярных соединений до
Сущность и классификация
Из-за разнообразия объектов исследования — от низкомолекулярных соединений до
Возможна классификация по типу иммунохимического взаимодействия на первой стадии анализа (в которой происходит связывание определяемого вещества):
Если в системе присутствуют только анализируемое соединение и соответствующие ему центры связывания (антиген и специфические антитела), то метод является неконкурентным.
Если же на первой стадии в системе одновременно присутствует анализируемое соединение и его аналог (меченное ферментом анализируемое соединение или анализируемое соединение, иммобилизованное на твердой фазе), конкурирующие за ограниченное количество центров специфического связывания, то метод является конкурентным.
Примером неконкурентного формата ИФА является «сэндвич»-метод. К носителю с иммобилизованными
Примером неконкурентного формата ИФА является «сэндвич»-метод. К носителю с иммобилизованными
Ферментативная реакция (цветная реакция) проходит в присутствии перекиси водорода и субстрата, представленного неокрашенным соединением, которое в процессе пероксидазной реакции окисляется до окрашенного продукта реакции на заключительном этапе проведения исследования. Интенсивность окрашивания зависит от количества выявленных специфических антител.
Результат оценивается спектрофотометрически или визуально.
«Сэндвич»-метод может быть использован для анализа только тех антигенов, на поверхности которых существуют, по крайней мере, две антигенные детерминанты. На этом формате основано большое количество тест-систем для иммуноферментной диагностики различных инфекций: ВИЧ-инфекция, вирусные гепатиты, цитомегаловирусная, герпесная, токсоплазменная и другие инфекции.
Среди конкурентных схем твердофазного ИФА существует два основных формата:
Прямой конкурентный
Среди конкурентных схем твердофазного ИФА существует два основных формата:
Прямой конкурентный
В непрямом конкурентном формате ИФА используются меченные ферментом антитела (специфические или
В непрямом конкурентном формате ИФА используются меченные ферментом антитела (специфические или
Если все три стадии ИФА проходят в растворе и между
Если все три стадии ИФА проходят в растворе и между
В основе гомогенного ИФА, применяемого, как правило, для определения низкомолекулярных субстанций, лежит ингибирования активности фермента при его соединении с антигеном или антителом. Активность фермента восстанавливается в результате реакции антиген-антитело.
При связывании антитела с антигеном, содержащим ферментную метку, происходит ингибирование активности фермента на 95% по отношению к высокомолекулярному субстрату, что обусловлено стерическим исключением субстрата из активного центра фермента. По мере увеличения концентрации антигена связывается все больше антител и сохраняется все больше свободных коңюгатов антиген-фермент, способных гидролизовать высокомолекулярный субстрат. Анализ проводят очень быстро, для одного определения требуется 1 минута. Чувствительность метода достаточно высока. С его помощью можно определить вещество на уровне пикомолей.
Для гетерогенных методов характерно проведение анализа в двухфазной системе с участием
Для гетерогенных методов характерно проведение анализа в двухфазной системе с участием
Методы относятся к гомогенно- гетерогенным, если 1 стадия – образование специфических комплексов происходит в растворе, а затем для разделения компонентов используют твердую фазу с иммобилизированным реагентом.
Как любые иммунохимические методы анализа, ИФА может давать ложноположительные и
Как любые иммунохимические методы анализа, ИФА может давать ложноположительные и
Например, ложноположительные результаты при определении антител к различным инфекциям могут возникнут за счёт ревматоидного фактора, представляющего собой иммуноглобулин M против собственных иммуноглобулинов G человека; за счёт антител, образующихся при различных системных заболеваниях, нарушениях обмена или приёме лекарственных препаратов; у новорождённых такие ложноположительные реакции могут возникать за счёт образования в организме ребёнка M-антител к иммуноглобулину G матери. Помимо этого, причиной ложнопололожительных результатов может быть синдром поликлональной активации. При этом, особые вещества — суперантигены — неспецифически стимулируют выработку B-лимфоцитами антител к различным инфекциям. Практически это выражается в неспецифическом нарастании титра антител сразу ко многим возбудителям. Ложноотрицательные результаты при определении антител могут быть обусловлены состояниями иммунодефицита, а также техническими ошибками при постановке реакции.
Ферменты
Ферментные метки обладают чрезвычайно мощьным каталитическим действием, одна молекула фермента
Ферменты
Ферментные метки обладают чрезвычайно мощьным каталитическим действием, одна молекула фермента
Ферментные маркеры, используемые в ИФА, должны обладать следующими свойствами:
– высокая
Ферментные маркеры, используемые в ИФА, должны обладать следующими свойствами:
– высокая
– наличие чувствительных субстратов и простота метода определения продуктов или субстратов ферментативной реакции;
– возможность адаптации субстратных систем к дальнейшему усилению;
– отсутствие фермента и его ингибиторов в исследуемой биологической жидкости.
В ИФА может использоваться не менее 15 различных ферментов. Наибольшее применение, в соответствии с вышеназванными требованиями, нашли пероксидаза хрена (ПХ), щелочная фосфотаза (ЩФ) и β-D-галактозидаза (табл.1). Все три стабильны и катализируют высокочувствительные реакции. Кроме того, продукты, получаемые в результате реакций, катализируемых этими ферментами, в зависимости от используемого субстрата, могут выявляться не только колориметрическими методами, но также флуоресцентными методами. Другие ферменты используются значительно реже. Это объясняется их более низкой в сравнении с ПХ и ЩФ удельной активностью.
Субстраты
Выбор субстрата в первую очередь определяется используемым в качестве метки
Субстраты
Выбор субстрата в первую очередь определяется используемым в качестве метки
Основные требования к субстрату:
– обеспечение высокой чувствительности метода при выявлении фермента в коңюгате;
– образование хорошо учитываемых (например, окрашенных) продуктов реакции фермент-субстрат;
– субстрат должен быть безопасным, дешевым, доступным и удобным для применения.
Ферменты и их субстраты наиболее широко используемые в ИФА.
Ферменты и их субстраты наиболее широко используемые в ИФА.
преимущества иммуноферментного анализа
— высокая чувствительность, позволяющая выявлять концентрации до 0, 05
преимущества иммуноферментного анализа
— высокая чувствительность, позволяющая выявлять концентрации до 0, 05
— возможность использовать минимальные объемы исследуемого материала;
— стабильность при хранении всех ингредиентов, необходимых для проведения ИФА (до года и более);
— простота проведения реакции;
— наличие как инструментального (в качественном и количественном варианте), так и визуального учета;
— возможность автоматизации всех этапов реакции
— относительно низкая стоимость диагностических наборов.
Основные типы тест-систем в зависимости от используемых антигенов
В зависимости
Основные типы тест-систем в зависимости от используемых антигенов
В зависимости
Лизатные — в которых используется смесь нативных антигенов (лизированный или обработанный ультразвуком возбудитель инфекции, полученный в культуре);
Рекомбинантные — в которых используются полученные генно-инженерным способом белки-аналоги определённых белковых антигенов возбудителя;
Пептидные — использующие химически синтезированные фрагменты белков.
Общее направление развития ИФА-диагностикумов — это направление от лизатных тест-систем, которые принято называть тест-системами первого поколения, к рекомбинантным и пептидным. Технология получения рекомбинантных белков позволяет получить в достаточно чистом виде аналог практически любого отдельного антигена. Для создания высококачественной рекомбинантной тест-системы необходимо из всего антигенного многообразия возбудителя выбрать антигены, которые были бы иммуногенными (то есть, в организме инфицированного человека должны вырабатываться антитела к этим антигенам) и высоко специфичными (то есть, характерными лишь для данного возбудителя и, по возможности, не дающими перекрёстных реакций с антителами к другим антигенам). Кроме того, большое значение имеет качество очистки рекомбинантных белков. В идеальном случае возможно получение рекомбинантной тест-системы практически со 100%-ной специфичностью при высокой чувствительности. На практике этого не всегда удаётся достичь, однако специфичность лучших рекомбинантных тест-систем приближается к 100 %.