Определение естественных регуляторных Т-клеток

Август 23, 2022

Главная
Медицина
Определение естественных регуляторных Т-клеток

Содержание

2. Как и следует из названия, регуляторные Т-лимфоциты (Treg) - клетки, выполняющие функции регулировщиков, или супрессоров, по
4. Существуют 3 группы подходов к определению и характеристике естественных Treg. Цитофлуорометрическое выявление экспрессии мембранных антигенов (CD4,
5. Цитофлуорометрическое определение Treg Метод основан на определении комбинации антигенов, характерных для Тreg, методом проточной цитометрии с
8. Нормативы. Содержание клеток с мембранным фенотипом CD4+ CD25+ в периферической крови составляет 2-3,5% от числа мононуклеаров,
9. Определение экспрессии гена FOXP3 с помощью Real Time ПЦР.
12. Оценка функции естественных регуляторных Т-клеток Выделение Treg при помощи магнитных бус. Отрицательная селекция CD4+ Положительная селекция
13. Методика постановки теста Активация клеток CD4+CD25- моноклональными антителами к CD3 (фиксир. на пластинке) Культивирование 12ч при
14. Методы оценки апоптоза.
15. Апоптоз- один из двух путей клеточной гибели. Он представляет собой гибель клетки, обусловленную нарушением условий существования
16. Роль апоптоза в иммунной системе состоит в контроле численности клеток, клонального состава популяций лимфоцитов, а так
17. Методы оценки: Морфологический Электрофоретический метод TUNEL- метод По связыванию аннексина V и окрашиваемости пропидия йодидом Регистрация
18. Метод оценки клеточной гибели по связыванию аннексина и окрашиваемости пропидия йодидом Принцип: определение экспрессии фосфатидилсерина, появляющегося
22. Скачать презентацию

Слайд 2

Как и следует из названия, регуляторные Т-лимфоциты (Treg) - клетки, выполняющие

функции регулировщиков, или супрессоров, по отношению к другим клетками иммунной системы. Treg контролируют иммунный ответ на чужеродные и аутоантигены и предотвращают развитие аутоиммунных процессов.
Известны по крайней мере два варианта регуляторных Т- клеток:
-Естественные (природные- natural), спонтанно развивающиеся в тимусе клетки (Тreg).
-Адаптивные, формирующиеся на периферии (индуцированные) (Th3- и Tr1-клетки).
Все эти клетки происходят из СD4+ T-лимфоцитов.

Слайд 3

Слайд 4

Существуют 3 группы подходов к определению и характеристике естественных Treg.
Цитофлуорометрическое выявление

экспрессии мембранных антигенов (CD4, CD25, CTLA-4)
Оценка экспрессии гена FOXP3.
Оценка функциональной активности Тreg.
Только комбинация всех трех подходов дает реальную информацию о состоянии субпопуляции Тreg.

Слайд 5

Цитофлуорометрическое определение Treg
Метод основан на определении комбинации антигенов, характерных для Тreg,

методом проточной цитометрии с помощью моноклональных антител, меченых флуорохромами.
Выявляют CD4, CD25, CTLA-4 (CD152)
Причем учитываются только клетки с высоким уровнем экспрессии CD25
Иногда в тест систему включается определение CD127 (не экспрессируется на Treg)

Слайд 6

Слайд 7

Слайд 8

Нормативы.
Содержание клеток с мембранным фенотипом CD4+ CD25+ в периферической крови составляет

2-3,5% от числа мононуклеаров, или 35- 100 клеток в 1 мкл.

Слайд 9

Определение экспрессии гена FOXP3 с помощью Real Time ПЦР.

Слайд 10

Слайд 11

Слайд 12

Оценка функции естественных регуляторных Т-клеток
Выделение Treg при помощи магнитных бус.
Отрицательная селекция

CD4+
Положительная селекция СD25+
Тест с подавлением пролиферативного ответа на стимуляцию клеток CD4+CD25-

Слайд 13

Методика постановки теста
Активация клеток CD4+CD25- моноклональными антителами к CD3 (фиксир. на

пластинке)
Культивирование 12ч при +4
+ смесь растворимых антител к CD28 и IL-2(рекомбинантный)
+ сингенные мононуклеары (АГ предст. Клетки)
Культивирование 60 часов при 37
Добавление 40кБк Тиминина
Культивирование 12 часов
Сбор данных

Слайд 14

Методы оценки апоптоза.

Слайд 15

Апоптоз- один из двух путей клеточной гибели. Он представляет собой гибель

клетки, обусловленную нарушением условий существования или прямым повреждающим действием внешних факторов, является активной формой гибели клетки, обусловлена включением через сигнальные пути механизмов, приводящих к деградации генетического материала и истощении энергетических ресурсов.
Различают: внутренний (митохондриальный ) и рецепторный.

Слайд 16

Роль апоптоза в иммунной системе состоит в контроле численности клеток, клонального

состава популяций лимфоцитов, а так же в повышении сродства В- лимфоцитов, а следовательно, и антител к антигену и в ограничении продолжительности иммунного ответа.
Формирования разрывов ДНК
Деградация и потеря клеткой части ДНК
Асимметрия мембраны с экспрессией на поверхности необычных молекул
Изменения морфологии клетки

Слайд 17

Методы оценки:
Морфологический
Электрофоретический метод
TUNEL- метод
По связыванию аннексина V и окрашиваемости пропидия йодидом
Регистрация

потери ДНК в тесте с применением пропидия йодида

Слайд 18

Метод оценки клеточной гибели по связыванию аннексина и окрашиваемости пропидия йодидом
Принцип:

определение экспрессии фосфатидилсерина, появляющегося на поверхности клетки вследствие нарушения асимметрии мембраны в процессе апоптоза, с помощью аннексина V (обладающего сродством к фосфатидилсерину), меченного флуорохромом.
Параллельно определяют некроз клеток, регистрируя появление проницаемости для пропидия йодида, связывающегося с ДНК клетки.
Нередко комбинируют с определением субпопуляционной принадлежности.

Слайд 19

Слайд 20

Определение естественных регуляторных Т-клеток

Содержание

Как и следует из названия, регуляторные Т-лимфоциты (Treg) - клетки, выполняющие

Существуют 3 группы подходов к определению и характеристике естественных Treg.Цитофлуорометрическое выявление

Цитофлуорометрическое определение TregМетод основан на определении комбинации антигенов, характерных для Тreg,

Нормативы.Содержание клеток с мембранным фенотипом CD4+ CD25+ в периферической крови составляет

Определение экспрессии гена FOXP3 с помощью Real Time ПЦР.

Оценка функции естественных регуляторных Т-клетокВыделение Treg при помощи магнитных бус.Отрицательная селекция

Методика постановки тестаАктивация клеток CD4+CD25- моноклональными антителами к CD3 (фиксир. на