Методы изучения регуляторных районов генов

геномной ДНК

Геномный
Southern blot анализ
с радиоактивным зондом
на интересующий район

Полноразмерный
рестрикционный
фрагмент

Расщепленный
Фрагмент соот-
ветствующий сайту
гиперчуствительности

ДНКазаI

Проба

Сайт рестрикции

Сайт гиперчуствительности
к ДНКазе

Сайт рестрикции

глюкокортикоид-индуцибельный энхансер (GRU) ТАТ в районе -5,5 т.п.н. от старта транскрипции

Печень-специфический cAMP-индуцибельный энхансер ТАТ в районе –3,6 т.п.н.от старта транскрипции.

Печень-специфический глюкокортикоид-индуцибельный энхансер (GRU) ТАТ в районе –2,5 т.п.н. от старта транскрипции

Регуляторные элементы промотора ТАТ.

Регуляторные районы гена тирозинаминотрансферазы
(ТАТ) крысы

отдаленного
регуляторного района

отдаленный
регуляторный район

Трансфекция клеток
репортерной плазмидой

Инкубация в течении 24-72 часов
транскрипция для эписомных плазмид и
синтез белка

Измерение
активности
фермента
репортерного гена

Измерение уровня
репортерной мРНК

Transcriptional Regulation in Eukaryotes: Concepts, Strategies, and Techniques. 2000, Cold Spring Harbor Laboratory Press

Методы исследования регуляторных районов

and applications.
Muerdter F1, Boryń ŁM2, Arnold CD3.

глюкокортикоид-индуцибельный энхансер (GRU) ТАТ в районе -5,5 т.п.н. от старта транскрипции

Печень-специфический cAMP-индуцибельный энхансер ТАТ в районе –3,6 т.п.н.от старта транскрипции.

Печень-специфический глюкокортикоид-индуцибельный энхансер (GRU) ТАТ в районе –2,5 т.п.н. от старта транскрипции

Регуляторные элементы промотора ТАТ.

Регуляторные районы гена тирозинаминотрансферазы
(ТАТ) крысы

факторов в регуляторных районах и (2) наличие в ядрах клеток большого разнообразия взаимодействующих с ними транскрипционных факторов, зависящего от стадии клеточного цикла, стадии индивидуального развития, состояния внутренней и внешней среды организма. Все это обеспечивает формирование огромного разнообразия вариантов транскрипционных комплексов и соответствующих им паттернов экспрессии одного и того же гена.

Организация регуляторных районов, контролирующих транскрипцию гена аполипопротеина В человека

30 сайтов связывания транскрипционных факторов и других типов регуляторных районов, суммарный размер которых превосходит длину кодируюей части этого гена.

receptors bind selectively in vitro to a cloned DNA fragment whose transcription is regulated by glucocorticoids in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 1981 Nov;78(11):6628-32.

in vitro to a cloned DNA fragment whose transcription is regulated by glucocorticoids in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 1981 Nov;78(11):6628-32.

Selectivity of receptor binding to MTV2-EE [32P]DNA: competition by excess unlabeled DNA. In one experiment (lanes A-G), 100 ng
of end-labeled EcoRI fiagments from pMTV2 were incubated with or without 500 ng of unlabeled closed circular pBR322 or pMTV2 DNA either in the presence or absence of glucocorticoid receptor for 60 min at 40C; DNA bound to nitrocellulose filters was eluted and analyzed on agarose gels.
Lanes: A, DNA prior to filter binding; B, DNA bound in the absence of added protein; C, DNA bound in the presence of glucocorticoid receptor; D and E, DNA bound in the absence of glucocorticoid receptor but in the presence of a 5-fold excess of unlabeled pBR322 orpMTV2 DNA, respectively; F and G, DNA bound in the presence of glucocorticoid receptor together with a 5-fold excess of unlabeled pBR322 or pMTV2 DNA, respectively.
In a second experiment (lanes H-L), 100 ng of the labeled pMTV2 fragments were first incubated in the presence or absence of glucocorticoid receptor for 30 min at 40C; 500 ng of either RSF2124 or pMTV2 DNA was then added and incubation was continued for an additional 30 min at 40C. Lanes: H and I, DNA bound in the absence of glucocorticoid receptor but in the presence of added pMTV2 or RSF2124 DNA, respectively; J, DNA bound in the presence of glucocorticoid receptor; K and L, DNA bound in the presence of glucocorticoid receptor and subsequently challenged with a 5-fold excess of unlabeled pMTV2 or RSF2124 DNA, respectively.

Первые исследования регуляторных элементов

- экзоны гена TDO2,
- старт транскрипции, R,L - правое и левое плечи вектора (λch4A), ● - сайты рестрикции EcoRI, I-V - фрагменты рестрикции λТО2.
- исследованный Данеш У. и сотр. участок гена; х - выявленные ими GREs
Б. Радиоавтограф геля после электрофореза EcoRI фрагментов λТО2 в 0,6% агарозе (1 - исходная ДНК, 2 - фрагменты ДНК, извлеченные из комплекса ДНК-рецептор-антитело на инактивированном S. Aureus).
В. Радиоавтограф геля после электрофореза фрагментов II и III в 1% агарозе (1 - фрагменты, задерживающиеся на нитроцеллюлозных фильтрах в присутствии рецептора, 2 - то же в отсутствие рецептора, 3 - исходная ДНК).

Merkulov V.M., Merkulova T.I. “Nucleotide sequence of a fragment of the rat tryptophan oxygenase gene showing high affinity to glucocorticoid receptor in vitro”. // Biochim. Biophys. Acta 1992. V.1132. P.100-102

of several functional domains. The variable NH2-terminal region (A/B) contains the ligand-independent AF-1 transactivation domain. The conserved DNA-binding domain (DBD), or region C, is responsible for the recognition of specific DNA sequences.
A variable linker region D connects the DBD to the conserved E/F region that contains the ligand-binding domain (LBD) as well as the dimerization surface. The ligand-independent transcriptional activation domain is contained within the A/B region, and the ligand-dependent AF-2 core transactivation domain within the COOH-terminal portion of the LBD.

A. Aranda, A. Pascual. Nuclear Hormone Receptors and Gene Expression. PHYSIOLOGICAL REVIEWS
Vol. 81, No. 3, July 2001

порезанные

32р

семенников крыс (Э) и с тем же экстрактом после его инкубации c АТ к SF-1 (Э + АТ)

SF-1
mut

StAR
(макака)
-228

Cyp11B3
(крыса)
-309

LHbeta
(свинья)
-114

Cyp11B1
(овца)
-337

Slp
(мышь)
+5299

SF-1
cons

Cyp11B1
(морская
свинка)
-126

SF-1
cons

SF-1
mut

Cyp17
(мышь)
-283

HSD3b (мышь)
-113

Ad
(бык)
-428

Cyp11B2
(крыса)
-324

Oxt (человек)
-159

SF-1
(мышь)
-224

- комплекс ДНК/SF-1, - комплекс ДНК/(SF-1 + неидентифицированный белок); при добавлении специфических антител наблюдается исчезновение (ослабление) этих комплексов Под названием гена указана позиция сайта относительно старта транскрипции

8 9 10 11 12 13 14 15
A 38 13 44 66 6 72 26 32 25 8 0 6 6 1 15
C 14 6 17 9 79 14 37 13 25 2 2 3 13 94 16
G 37 71 20 9 10 5 17 24 29 3 97 2 8 2 5
T 11 10 19 16 5 9 20 31 21 87 1 89 73 3 68
Cons G/A G А A C A N N N T G T T C T

Частотные матрицы и варианты консенсуса GRbs, полученные в результате анализа 25 (А) и 81 (B) экспериментально выявленных сайтов

Частоты встречаемости нуклеотидов выражены в %

Позитивные GREs (n = 25)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
A 5 15 10 55 10 55 40 15 20 15 0 5 5 0 5
C 25 0 20 10 75 25 25 15 35 0 0 0 25 100 10
G 45 65 20 0 0 10 15 25 25 5 95 5 5 0 0
T 25 20 50 35 15 10 20 45 20 80 5 90 65 0 85
Cons G G T A C A N N N T G T T C T

I

образование димера ГР.
В виде димера ГР, как правило, активирует транскрипцию (сверху).
Наличие мономера ГР в любом из вариантов ДНК-белковых комплексов обычно подавляет транскрипцию (внизу).
Треугольник означает другой фактор транскрипции.

Lefstin JA, Yamamoto KR, 1998

на гипоксию)

The indicated 5’ or 3’ deletion
mutant of the ROR4 reporter was transfected along with pSVgal into Caco2 cells.
Eighteen hours after transfection the cells were cultured for 24 h under normoxia (open bar) or hypoxia (closed bar).
Relative luciferase
activity is represented, normalized to that in the transfected cells cultured under normoxia.

Miki N, Ikuta M, Matsui T. Hypoxia-induced activation of the retinoic acid receptor-related orphan receptor a4 gene by an interaction between hypoxia-inducible factor-1 and Sp1. J Biol Chem. 2004 Apr 9;279(15):15025-31.

метода для
исследования функциональности сайта. Пример 1

A) Sequence of a wild -type and mutant
pGL3-CRLR reporter plasmids. pGL3-CRLR-516 and pGL3-CRLR-516 mut sequences were identical (hyphens) except for a 3-bp substitution within the HIF-1 binding site (underlined).
B) Transient expression assay. Primary human dermal microvascular endothelial cells were transfected with ph PG-TK and pGL3-CRLR-516 or pGL3-CRLR-516 mut.
Transfected cells were incubated at 20% O2 for 4 h, and then triplicate plates were incubated at 20 or 0.1% O2 for 16 h. The
pGL3/ph PG-TK ratio was determined for each plate and was normalized to the results for pGL3-CRLR-516 in cells at 20% O2 (Relative pGL3/firefly-activity). The ratio of relative pGL3 activity was also calculated to determine induction by hypoxia.

Effect of site-directed mutagenesis on CRLR promoter function.

Chen KF, Lai YY, Sun HS, Tsai SJ. Transcriptional repression of human cad gene by hypoxia inducible factor-1a. Nucleic Acids Res. 2005 Sep 9;33(16):5190-8.

метода для
исследования функциональности сайта. Пример 2

T. Fink, A. Kazlauskas, L. Poellinger, P. Ebbesen, and V. Zachar. Identification of a tightly regulated hypoxia-response element in the promoter of human plasminogen activator inhibitor–1. Blood. 2002; 99:2077-2083

The transcriptional activation was measured by a luciferase reporter assay. HepG2 cells were transiently transfected with wild-type and mutated promotor constructs. For each construct wild-type HRE1-5 are indicated. After transfection, the cells were cultured at either 21% or 1% oxygen for 24 hours before the assessment of luciferase activity. In each experiment, luciferase activity of cells cultured in hypoxia was determined relative to that of ambient control cells.
(A) Enhancement of luciferase activity in wild-type promotor
construct after incubation at 1% oxygen.
(B) Effect of mutations of single HREs on the hypoxia-mediated induction.
(C) Capacity of individual wild-type HREs to drive transcriptional expression from the PAI-1 promotor after hypoxic treatment.

экспрессии гена САТ.

А) Схема гена МТI мыши, Б) схемы плазмид использованных для трансфекции LTK- - клеток. старт транскрипции, EI, EII и EIII - экзоны гена МТI мыши, ТК - промотор гена тимидинкиназы вируса герпеса простого, САТ- структурная часть гена хлорамфениколацетилтрансферазы. В таблице приведены значения коэффициента индукции гена САТ под действием дексаметазона и число опытов. Достоверность разницы оценивалась с помощью критерия Стьюдента для малых выборок. * P>0,95 относительно pTKCAT; ** P >0,95 относительно pMT2CAT.

Harbor Laboratory Press

Genomic footprinting

Harbor Laboratory Press

Ligation-mediated PCR

LM-PCR is a powerful technique for detecting DNA strand breaks within a complex sample.
The technique is well suited for this purpose because of its extreme sensitivity and specificity.
LM-PCR was first described by Barbara Wold and colleagues.
The technique is typically performed on purified genomic or plasmid DNA that has previously been cleaved with limiting concentrations of a nuclease (e.g., DNase I, micrococcal nuclease, or a restriction endonuclease).
Alternatively, LM-PCR can be performed on DNA that had been modified with DMS or potassium permanganate, followed by strand cleavage at the modified nucleotides by piperidine.

expression

Intact nuclei isolated from brain and liver cells of Smn/ mice expressing eight copies of human SMN2 gene were exposed to limited dimethylsulfate treatment, and genomic DNA was isolated. The DNA was then subjected to piperidine treatment followed by LM-PCR amplification of the SMN2 promoter. The LM-PCR products were separated on 6% sequencing gel and exposed to x-ray film. N, naked DNA, where DNA was treated with dimethyl sulfate and piperidine after isolation; C, DNA isolated from control cells treated in vivo with dimethyl sulfate. The stars and arrows indicate hypersensitive and protected G residues, respectively. A, lower strand spanning from 210 to 283 bp. B, upper strand spanning from 312 to 443 bp of the SMN2 promoter

S. Majumder, S. Varadharaj, K. Ghoshal et al. Identification of a Novel Cyclic AMP-response Element (CRE-II) and the Role of CREB-1 in the cAMP-induced Expression of the Survival Motor Neuron (SMN) Gene //The Journal of Biological Chemistry / Vol. 279, No. 15, Issue of April 9, pp. 14803–14811, 2004

мыши

Семенники мышей линии C57Br возраста 7-10 дней

7.0
FACTOR 6133
Homo sapiens 1040
Mus musculus 765
D.melanogaster 233
A.thaliana 1751
S.Cerevisiae 368
SITE 7915
MATRIX 398
GENE (all entries) 2397
H.sapiens 608
M.musculus 417
D.melanogaster 145
A.thaliana 115
S.cerevisiae 195
GENE (entries with SITE links) 1504
CLASS 50
CELL 1307
TRANSCompel Rel. 7.0
COMPEL (composite elements) 322

V. Matys*, O. V. Kel-Margoulis, E. Fricke, I. Liebich, S. Land, A. Barre-Dirrie, I. Reuter, D. Chekmenev, M. Krull, K. Hornischer, N. Voss, P. Stegmaier, B. Lewicki-Potapov, H. Saxel, A. E. Kel and E. Wingender

E.V., Ananko E.A., Podkolodnaya O.A., Stepanenko I.L., Merkulova T.I., Pozdnyakov M.A., Podkolodny N.L., Naumochkin A.N., Romashchenko A.G.