Генетические методы типирования HLA системы метод секвенирования

Август 2, 2022

Главная
Биология
Генетические методы типирования HLA системы метод секвенирования

Содержание

2. HLA типирование - исследование главного комплекса гистосовместимости человека - HLA комплекса. Это образование включает в себя
3. Задачи Биологическая идентификация (HLA-тип наследуется вместе с родительскими генами), определение предрасположенности к различным заболеваниям, подбор доноров
4. HLA-типирование методом секвенирования По Сэнгеру NGS: Roche/454 Life Sciences Illumina/Solexa Applied Biosystems/SOLiD Одномолекулярное секвенирование Helicos Biosciences
5. HLA-типирование основанное на технологии секвенирования по Сэнгеру HLA-секвенирование по Сэнгеру является золотым стандартом в высокоразрешающем HLA-типировании
6. В классическом варианте метода Сэнгера одна из цепочек анализируемой ДНК выступает в качестве матрицы для синтеза
11. На сегодняшний день секвенирование ДНК по Сэнгеру полностью автоматизировано и проводится на специальных приборах, секвенаторах. Использование
12. HLA-типирование методом секвенирования следующего поколения (NGS) Секвенирование нового поколения— техника определения нуклеотидной последовательности ДНК и РНК
13. Основные принципы всех методов Все основные принципы работы технологий СНП базируются на секвенировании ДНК-чипов, используя интерактивные
14. Этапы Первый этап секвенирования — создание библиотеки случайных последовательностей ДНК, которые можно будет сшить с общедоступными
16. Roche/454 Life Sciences Первая эффективно используемая на коммерческой основе платформа СНП. Компания 454 Life Sciences основана
18. Illumina/Solexa Авторы метода — британские химики Шанкар Баласубраманиан и Дэвид Кленерман. Этот метод секвенирования использует прикреплённые
20. Applied Biosystems/SOLiD Платформа SOLiD (Supported Oligonucleotide Ligation and Detection System 2.0), разработанная Applied Biosystems — технология
22. Одномолекулярное секвенирование Helicos Biosciences Первый метод секвенирования единичных молекул, разработанный HeliScope имеет производительность около 1Gb/день. Принцип
23. Одномолекулярное секвенирование в реальном времени Pacific Biosciences Метод одномолекулярного секвенирование в реальном времени (SMRT) основан на
25. Ion Torrent Sequencing Метод основан на связи между химической и цифровой информацией, что позволяет быстрее и
28. Нанопоровое секвенирование Метод основан на измерении тока ионов через единичную нанопору в непроводящей мембране. При прохождении
30. Сравнение методов
32. Скачать презентацию

Слайд 2

HLA типирование - исследование главного комплекса гистосовместимости человека - HLA комплекса.

Это образование включает в себя область генов на 6-й хромосоме, которые кодируют HLA-антигены, участвующие в различных реакциях иммунного ответа.

Слайд 3

Задачи
Биологическая идентификация (HLA-тип наследуется вместе с родительскими генами),
определение предрасположенности к различным

заболеваниям,
подбор доноров для пересадки органов - при этом производится сравнение результатов HLA типирования тканей донора и реципиента.
С помощью HLA типирования определяют, и насколько супруги сходны или различимы по антигенам тканевой совместимости, чтобы диагностировать случаи бесплодия.

Слайд 4

HLA-типирование методом секвенирования
По Сэнгеру
NGS:
Roche/454 Life Sciences
Illumina/Solexa
Applied Biosystems/SOLiD
Одномолекулярное секвенирование Helicos

Biosciences
Одномолекулярное секвенирование в реальном времени Pacific Biosciences
Ion Torrent Sequencing
Нанопоровое секвенирование

Слайд 5

HLA-типирование основанное на технологии секвенирования по Сэнгеру
HLA-секвенирование по Сэнгеру является золотым

стандартом в высокоразрешающем HLA-типировании и уже много лет успешно используется в многочисленных лабораториях.
Метод Сэнгера — метод секвенирования (определения последовательности нуклеотидов) ДНК, также известен как метод обрыва цепи. Впервые этот метод секвенирования был предложен Фредериком Сэнгером в 1977 году, за что он был удостоен Нобелевской премии по химии в 1980 году. Данный метод был наиболее распространенным на протяжении 40 лет.

Слайд 6

В классическом варианте метода Сэнгера одна из цепочек анализируемой ДНК выступает

в качестве матрицы для синтеза комплементарной цепочки ферментом ДНК-полимеразой.
Реакцию с одной и той же матрицей проводят в четырёх разных пробирках, каждая из которых содержит:
праймер — небольшую одноцепочечную молекулу ДНК, комплементарную началу участка, который нужно отсеквенировать. Праймер необходим потому, что ДНК-полимеразы не могут начинать синтез цепи «с пустого места», они только присоединяют следующий нуклеотид к уже имеющейся 3'-гидроксильной (OH) группе предыдущего. Праймер, таким образом, представляет собой «затравку» при синтезе ДНК;
четыре стандартных дезоксинуклеотида (dATP, dGTP, dCTP и dTTP);
небольшое количество (в концентрации 1 к 100) одного из радиоактивно меченных дезоксинуклеотидов (дидезоксинуклеотида) (например, [32P]-дАТФ), который включается в состав ДНК во время синтеза и позволяет впоследствии визуализировать продукты реакции.

Слайд 7

Слайд 8

Слайд 9

Слайд 10

Слайд 11

На сегодняшний день секвенирование ДНК по Сэнгеру полностью автоматизировано и проводится

на специальных приборах, секвенаторах.
Использование дидезоксинуклеотидов с флуоресцентными метками с разными длинами волн испускания позволяет проводить реакцию в одной пробирке. Реакционную смесь разделяют капиллярным электрофорезом в растворе, фрагменты ДНК, выходящие из капиллярной колонки, регистрируются детектором флуоресценции.
Результаты анализируют с помощью компьютера и представляют в виде последовательности разноцветных пиков, соответствующих четырём нуклеотидам.
Секвенаторы такого типа могут «прочитывать» за один раз последовательности длиной 500—1000 нуклеотидов.

Слайд 12

HLA-типирование методом секвенирования следующего поколения (NGS)
Секвенирование нового поколения— техника определения нуклеотидной

последовательности ДНК и РНК для получения формального описания её первичной структуры.
Технология методов секвенирования нового поколения (СНП) позволяет «прочитать» единовременно сразу несколько участков генома, что является главным отличием от более ранних методов секвенирования. СНП осуществляется с помощью повторяющихся циклов удлинения цепи, индуцированного полимеразой, или многократного лигирования олигонуклеотидов.
В ходе СНП могут генерироваться до сотен мегабаз и гигабаз нуклеотидных последовательностей за один рабочий цикл.

Слайд 13

Основные принципы всех методов
Все основные принципы работы технологий СНП базируются на

секвенировании ДНК-чипов, используя интерактивные циклические ферментативные реакции с дальнейшим сбором полученной информации в виде иллюстраций.
Полученные данные используются для восстановления нуклеотидной последовательности или, как для технологии SOLiD, динуклеотидных «цветов».
Несмотря на разные методы получения копий (амплификация) участков генома и на техническую разницу дифференциации различных нуклеотидов в прочтённых последовательностях, общая схема работы для всех секвенаторов одна.

Слайд 14

Этапы
Первый этап секвенирования — создание библиотеки случайных последовательностей ДНК, которые можно будет

сшить с общедоступными адаптерными последовательностями.
Второй этап — создание ампликонов с помощью ПЦР, которые будут использованы как образцы.
Третий этап — определение первичной структуры всех фрагментов.

Слайд 15

Слайд 16

Roche/454 Life Sciences
Первая эффективно используемая на коммерческой основе платформа СНП. Компания

454 Life Sciences основана в 2000 году Джонатаном Ротбергом (в производство запущена в 2005 году). Данная технология представляет собой последовательный синтез методов эмульсионного ПЦР и пиросеквенирования.
Амплификация ДНК проходит в каплях воды в масляной эмульсии. В каждой капле воды находится одноцепочечная матрица ДНК, связанная с праймером на бусинке. Далее, каждая бусина помещается на чип, представляющий собой оптическое волокно. Туда же помещаются необходимые для секвенирования ферменты: ДНК-полимераза, люцифераза, АТФ-сульфурилаза.
В последней сборке реакция секвенирования идет в ячейках объемом 3,4·106 пкл, на стенках которых есть специальное металлическое покрытие, нивелирующее шум.

Слайд 17

Слайд 18

Illumina/Solexa
Авторы метода — британские химики Шанкар Баласубраманиан и Дэвид Кленерман. Этот метод секвенирования

использует прикреплённые к микросферам единичные молекулы ДНК.
В 2006 году была запущена Solexa Genome Analyzer 1G, первая платформа, генерирующая короткие участки генома. После её приобретения компанией Illumina Genome Analyzer использует оптически прозрачные ячейки с 8 индивидуальными поверхностями, где связываются олигонуклеотиды.
В отличие от пиросеквенирования удлинение последовательности происходит постепенно, что позволяет за раз с помощью камеры снимать большие ДНК-чипы.

Слайд 19

Слайд 20

Applied Biosystems/SOLiD
Платформа SOLiD (Supported Oligonucleotide Ligation and Detection System 2.0), разработанная

Applied Biosystems — технология секвенирования коротких чтений, основанная на лигировании.
Метод был предложен в лаборатории Георга Черча и опубликован в 2005 году (был заново просеквенирован геном Escherichia coli).
По технологии SOLiD при секвенировании фрагменты ДНК лигируются на олигонуклеотидные адаптеры, прикрепленные к шарикам, далее они амплифицируются с помощью эмульсионной ПЦР.

Слайд 21

Слайд 22

Одномолекулярное секвенирование Helicos Biosciences
Первый метод секвенирования единичных молекул, разработанный HeliScope имеет

производительность около 1Gb/день.
Принцип работы: после клональной амплификации образца происходит фрагментация ДНК с последующим полиаденилированием на 3'-конце с дальнейшим секвенированием, чередующимся с промыванием образцов нуклеотидами с флуоресцентной меткой.

Слайд 23

Одномолекулярное секвенирование в реальном времени Pacific Biosciences
Метод одномолекулярного секвенирование в реальном

времени (SMRT) основан на наблюдении за работой единичной молекулы ДНК-полимеразы.
Использование четырех флуоресцентно-меченных нуклеотидов позволяет определить, какой нуклеотид присоединяет ДНК-полимераза в данный момент.

Слайд 24

Слайд 25

Ion Torrent Sequencing
Метод основан на связи между химической и цифровой информацией,

что позволяет быстрее и проще секвенировать большое количество образцов.
Эта технология также называется рН-индуцированным секвенированием. Процесс основан на детекции протонов, которые получаются при синтезе цепи ДНК как побочный продукт. Как следствие, рН раствора меняется, что и можно детектировать.
Платформа Ion Torrent отличается от остальных технологий секвенирования тем, что в ней не используются модифицированные нуклеотиды и оптические методы.
Метод Ion Torrent позволяет исследовать транскриптомы, малые РНК, проводить ChIP-seq.

Слайд 26

Слайд 27

Слайд 28

Нанопоровое секвенирование
Метод основан на измерении тока ионов через единичную нанопору в

непроводящей мембране.
При прохождении через эту пору нуклеотидов ток падает.
Время, на которое изменяется ток ионов, и величина этого падения зависят от того, какой нуклеотид в данный момент находится внутри поры.

Слайд 29

Слайд 30

Генетические методы типирования HLA системы метод секвенирования

Содержание

HLA типирование - исследование главного комплекса гистосовместимости человека - HLA комплекса.

ЗадачиБиологическая идентификация (HLA-тип наследуется вместе с родительскими генами),определение предрасположенности к различным

HLA-типирование методом секвенированияПо Сэнгеру NGS:Roche/454 Life SciencesIllumina/SolexaApplied Biosystems/SOLiDОдномолекулярное секвенирование Helicos

HLA-типирование основанное на технологии секвенирования по СэнгеруHLA-секвенирование по Сэнгеру является золотым

В классическом варианте метода Сэнгера одна из цепочек анализируемой ДНК выступает

На сегодняшний день секвенирование ДНК по Сэнгеру полностью автоматизировано и проводится

HLA-типирование методом секвенирования следующего поколения (NGS)Секвенирование нового поколения— техника определения нуклеотидной

Основные принципы всех методов Все основные принципы работы технологий СНП базируются на

ЭтапыПервый этап секвенирования — создание библиотеки случайных последовательностей ДНК, которые можно будет

Roche/454 Life SciencesПервая эффективно используемая на коммерческой основе платформа СНП. Компания

Illumina/SolexaАвторы метода — британские химики Шанкар Баласубраманиан и Дэвид Кленерман. Этот метод секвенирования

Applied Biosystems/SOLiDПлатформа SOLiD (Supported Oligonucleotide Ligation and Detection System 2.0), разработанная

Одномолекулярное секвенирование Helicos BiosciencesПервый метод секвенирования единичных молекул, разработанный HeliScope имеет

Одномолекулярное секвенирование в реальном времени Pacific BiosciencesМетод одномолекулярного секвенирование в реальном

Ion Torrent SequencingМетод основан на связи между химической и цифровой информацией,

Нанопоровое секвенированиеМетод основан на измерении тока ионов через единичную нанопору в

Сравнение методов

Похожие презентации