Отбор, транспортировка и хранение материала для исследования методом ПЦР

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
ПЦР – это метод лабораторной диагностики, направленный

Этапы ПЦР

Денатурация ДНК
(95оС)

Отжиг праймеров
(55-65оС)

Полимеризация цепей ДНК
(72оС)

Цикличность реакции амплификации

N=1

N=40

N – количество
циклов ПЦР

Экспоненциальный характер течения ПЦР

Основные характеристики ПЦР

Высокая чувствительность, основанная на экспоненциальном принципе накопления продукта.
Высокая специфичность,

Характеристика тест-систем на основе ПЦР
Высокая специфичность, основанная на выявлении уникальных для

Преимущества метода ПЦР
Прямой метод обнаружения возбудителя
Широкий спектр биологического материала
Кровь, сыворотка
Моча
Фекалии
Соскобы, мазки

Особенности применения метода ПЦР
Адекватный материал
Где искать?
Когда искать?
Хранение, транспортировка материала
Как хранить?
Как транспортировать?

Экстракция нуклеиновых кислот (НК) - получение очищенного препарата НК

Гемоглобин
Гепарин
Иммуноглобулины
Билирубины и желчные кислоты
Слизь (мукополисахариды)
Гормоны
Ферменты
Ионы металлов (Ca2+, Fe3+)
Соли
Продукты жизнедеятельности микрофлоры
Высокомолекулярная геномная

Быстрые в исполнении, НО!
Низкая эффективность очистки от ингибиторов
Нет концентрирования
Непригодны

Сложные – сорбция ДНК/РНК на носителе/ преципитация НК и удаление ингибиторов

Сложные методы экстракции нуклеиновых кислот

Лизис хаотропными агентами (н-р. гуанидинтиоцианат) ⇒ сорбция

Экстракция ДНК/РНК сорбцией на силикагеле

Отмывка от солей
этанолом

Элюция РНК/ДНК
Водой или
TE-буфером
Подсушивание

Схема экстракции НК сорбцией на колонках

Лизис

Сорбция НК

Удаление примесей

Элюция НК

Перенос НК в

Методы одновременной экстракции ДНК/РНК

Контроль взятия и сохранности материала (эндогенный)
Потери ДНК/РНК (эффективность экстракции)
Полнота удаления ингибиторов
Контроль

РНК/ДНК
Эндогенный – экзогенный
Флуоресцентные - электрофоретические

Общая классификация (ВК)

РНК и ДНК контроли

Экстракция НК

э/ф детекция

вко

В-

образцы

Использование экзогенного ВК при проведении ПЦР-исследования

В-

В-

К-

К+

Конкурентный ВКО (амплификация одинаковыми праймерами со спецификой)

А

А

В

пко

вко

пко

вко

Отличается по составу внутренней части
и

Неконкурентный ВКО (амплификация разными праймерами со спецификой)

пко

вко

пко

вко

Электрофоретическая
детекция

Флуоресцентная
детекция

Способы детекции ВК для ЭФ и флуоресцентных методов

пко

вко

пко

вко

ВКО

пко

Электрофоретическая
детекция

Флуоресцентная
детекция

Адекватный вид материала
Зачем искать?
Где искать?
Когда искать?
Правильное взятие материала
Хранение и транспортировка
по инструкции
Метод

Цель
Мониторинг
Скрининг
Выявление этиологического агента
другие
Патогенез
Где искать?
Когда искать?
Возраст и пол
Вид животного

Ключевые моменты выбора материала

Асептика и антисептика
Одноразовые пробирки
Индивидуальные инструменты
Количество, достаточное для повторного исследования
Понятная маркировка
Правильная упаковка

Принципы

Кровь, сыворотка/плазма
Материал из респираторного тракта
Урогенитальные мазки
Сперма
Фекалии, помет, ректальные мазки
Молоко
Корма
Вода

Материал для ПЦР-исследования

Цельная кровь
Отбор в одноразовые пробирки
ЭДТА или цитратом натрия
Гемолитик
РИБО-сорб (РНК), РИБО-преп

Кровь
Биохимия, серология, ИФА
Пробирка покрыта тонкодисперсными частицами диоксида кремния, которые ускоряют процесс

Игла прокалывает резиновую крышку пробирки. Образуется канал между пробиркой и

КРС
Лошади
Из яремной вены (v. jugularis)
Кровь берут в нижней

Свиньи
Из ушной вены (v. auricularis)
Из яремной вены (v.jugularis)
Из хвостовой вены

Мелкие домашние животные
из лучевой (v. radialis) вены
из бедренной (v. femoralis)

Материал из респираторного тракта
Мазки из рото- и носоглотки
Стерильный одноразовый зонд из

Материал из респираторного тракта
Трахеобронхиальный лаваж – 20 мл
Бронхоальвеолярный лаваж – 20

Материал из урогенитального тракта
Мазки, соскобы
РИБО-сорб, РИБО-преп, ДНК-сорб-В – 100 мкл
Смывы с

Фекалии, помет
Не менее 5 гр в стерильном контейнере
10-20% суспензия
РИБО-сорб, РИБО-преп, ДНК-сорб-В

Особенности предобработки материала методом экспресс-фильтрации

Суспензия фекалий

Фильтрат суспензии фекалий

Фильтрат суспензии фекалий рекомендовано

Патматериал
Фрагменты тканей и органов 1х1х1 см
Отбор из очага поражения
Формирование усредненной пробы
Гомогенизация
РИБО-сорб,

Транспортировка и хранение
Транспортировка
В течение суток при температуре +2 - +8 без

РАБОТА НАД ОШИБКАМИ

Ошибки преаналитического этапа
Ошибки аналитического этапа
Ошибки постаналитического этапа

Ошибки преаналитического этапа
Место взятия биологического материала
Правильность взятия биологического материала
Обработка биологического материала
Хранение

Взятие биологического материала
Неверное определение места предполагаемой локализации инфекционного процесса, особенно для

Взятие биологического материала
Материал должен содержать максималь-ную концентрацию микроорганизмов
Минимальное количество примесей, спо-собных

Обработка биологического материала
Необходимо использовать антикоагулянты
Присутствие гепарина в крови (антикоагу-лянтная терапия) может

Хранение биологического материала
Разрушение РНК и ДНК возбудителей при нарушении сроков хранения

Нормативная документация
СП 1.2.036-96
СП 1.3.1285-03
СП 1.3.2322-08

Ошибки аналитического этапа
Выбор системы пробоподготовки
Технологические ошибки

Выбор системы пробоподготовки
Неправильный выбор системы пробоподготовки
Использование экспресс-методов на «сложных» образцах, может

Технологические ошибки
Электрофоретическая детекция
Риск принять неспецифические фрагменты за специфические при отсутствии К+

Ошибки постаналитического этапа
Ошибки интерпретации результатов ПЦР
Сравнение результатов ПЦР и ИФА
Сравнение ПЦР

Ошибки интерпретаци результатов ПЦР
Неверная интерпретация результатов ПЦР-анализа, вследствие ошибочных представлений об

Сравнение результатов ПЦР и ИФА
Наличие серологического окна
Развитие иммунологической толерантности
Генетически обусловленная серонегативность
Выявление

Сравнение результатов ПЦР и микроскопии
Низкая чувствительность микроскопии
Субъективность оценки результатов
Ограниченный спектр выявляемых