Получение белка в биотехнологическом производстве

Июль 26, 2022

Главная
Биология
Получение белка в биотехнологическом производстве

Содержание

2. Дрожжи. Бактерии. Водоросли Грибы. Основные продуценты белка используемые в фарм. биотехнологическом производстве:
3. Использование различных микроорганизмов в качестве источников белка и витаминов обусловлено факторами: а) возможностью использования для культивирования
4. 1. Основанное на использовании живой или инактивированной биомассы микроорганизмов. К ним относится производство пекарских, винных и
5. Для получения белка одноклеточных микроорганизмов используют различные субстраты: парафины нефти, метан, водород, метанол, этанол, уксусную кислоту,
6. В 1957г. Айзекс и Линдеман обнаружили, что клетки животных, инфицированных вирусами, выделяют в сферу фактор, который
7. 1. Обладает антивирусным действием - интерферон не действует на внеклеточный вирус, а стимулирует образование интерлейкина-2, увеличивает
8. 4. Интерферон обладает антимикробной активностью 5. Оказывает радиозащитное действие. 6. Интерферон является иммуномодулятором – т. е.
9. 1. Лейкоцитарный или α-IFN - получают в культуре лейкоцитов выделенных из крови доноров. Различают 20 рекомбинантных
10. 1. Экзогенная – введение готового интерферона в организм, использование мазей, содержащих интерферон. 2. Эндогенная – введение
11. 1. Стимулируют фагоцитоз и биосинтез антител. 2. Тормозят рост и метастазирование опухолей. 3. Проявляют антиклеточную активность.
12. 1. Выделение иРНК, несущую информацию о структуре молекулы интерферона (РНК выделяют после индукции синтеза интерферона); 2.
13. 5.Получение клонов рекомбинантных продуцентов, способных синтезировать интерферон (на плотной питательной среде); 6.Размножение клоновой культуры – продуцента
14. 9. Очистка интерферона после растворения осадка с помощью аффинной хроматографии при использовании сорбента, связанного с моноклональными
15. 1. На основе сконструированных рекомбинантных ДНК, экспрессируемых в клетках E. coli (α, β, α-IFN). 2. Возможен
16. По характеру действия и клинической значимости препараты разделены на 4 основные группы: этиотропные, действующие на возбудителя
17. Антивирусные средства делят на 4 группы: химиопрепараты; интерфероны; индукторы ИНФ; иммуномодуляторы. Химиопрепараты – главным образом средства
18. Применение интерферона имеет ряд преимуществ: 1. Широкий спектр действия, что очень важно при терапии вирусных пневмоэнтеритов.
19. Применение интерферона имеет ряд недостатков: Короткий период сохранения в организме (до 12ч.). Препарат применяется в основном
20. Интерлейкины. Интерлейкины (ИЛ) – вещества белковой или гликопротеидной природы, синтезируемые преимущественно иммунокомпетентными клетками. В настоящее время
21. ИЛ 1 – цитокин, выделяемый макрофагами, стимулирующий функции Т и В-лимфоцитов. С участием ИЛ 1 активируются
22. ИЛ 4 – фактор стимуляции В-клеток и части Т-лимфоцитов. Регулирует аллергические реакции организма. С помощью ИЛ
23. В качестве продуцентов интерлейкинов используют: культуры нормальных лимфоцитов или макрофагов; клоны трансформированных (опухолевых) клеток; Т-клеточные гибридомы
24. Продуценты культивируют in vitro в сосудах определенного объема, затем ИЛ выделяют из культуральной среды, концентрируют, очищают.
25. Для создания рекомбинантных микроорганизмов – продуцентов ИЛ: -гены, контролирующие их синтез, вводят в составе вектора в
26. Гормон роста: обладает анаболическим действием, повышает в клетках уровень биосинтетических процессов, усиливает биосинтез белков, ДНК, РНК
27. При синтезе ДНК на мРНК гормона с последующим превращением ее в двухнитиевую форму получается ген, кодирующий
28. На втором этапе клонировали синтетический полинуклеотид, соответствующий аминокислотам от 1-й до 23-й. На третьем этапе два
29. - Нарушение секреции инсулина вследствие деструкции β-клеток - абсолютная недостаточность инсулина - является ключевым звеном патогенеза
30. Инсулин человека можно производить четырьмя способами: 1) полным химическим синтезом; 2) экстракцией из поджелудочных желез человека
31. История открытия инсулина вторая половина 19 века русский врач И.М. Соболев доказал, что уровень сахара в
32. - в 1954 году английский биохимик Г.Сенджер расшифровал структуру инсулина. К концу 60-х годов развитие методов
33. I. Выделение инсулина из животного сырья Получение инсулина состоит из ряда стадий: 1. Измельчение замороженных поджелудочных
34. 1. замороженные поджелудочные железы измельчают в мясорубке-волчанке; 2. экстрагируют способом бисмацерации 1,5-4 часа при постоянном перемешивании
35. 3. Полученные вытяжки объединяют, отставляют на холоде на 48 ч для освобождения от нежелательных белков, которые
36. 7. Десорбцию инсулина осуществляют с помощью 0,01-0,05 раствора аммонийного буфера (pH 10) и немедленно подкисляют хлороводородной
37. 13. Для медленной кристаллизации инсулина создают условия с последовательным изменением pH раствора: раствор подщелачивают до pH
38. II.Создание промышленного производства генно-инженерного инсулина. Технология разработана совместно с немецкой фирмой Genbiotech GmbH (Гейдельберг) в 1987—1989
39. Технологическая схема включала в себя стадии: Схема 1: 1. Ферментация (выращивание штамма-продуцента в ферментере). 2. Отделение
40. 7. Хроматографическая очистка гексасульфоната проинсулина (3 стадии): гель-фильтрацией на Сефадексе G-50 F, ионообменной хроматографией на DEAE-сефарозе
41. Технологическая схема включала в себя стадии: Схема 2 (с 2012 г.): 1. Получение посевного материала штамма-продуцента
42. Технологическая схема включала в себя стадии: Схема 2 (с 2012 г.): 3. Выделение и очистка рекомбинантного
43. В основе процесса биосинтеза — использование штамма-продуцента Е. coli JM 109 с рекомбинантной плазмидой pPINS 07.
44. 1. Клетки продуцента рекомбинантного препроинсулина человека отделяют сепарированием, дезинтегрируют при высоком давлении для сбора телец включения,
45. 4. Ренатурированный рекомбинантный белок очищают ионообменной хроматографией. 5. Белок подвергают ферментативному расщеплению трипсином и карбокси-пептидазой Б
46. финишная гель-фильтрация проходит в стерильных условиях и позволяет довести качество препарата до фармакопейного. 7. В завершении
47. Требования к качеству субстанции инсулина человека изложены в соответствующих разделах Американской Фармакопеи (Ф. США) и Европейской
49. Скачать презентацию

Слайд 2

Дрожжи.
Бактерии.
Водоросли
Грибы.
Основные продуценты белка используемые в фарм. биотехнологическом производстве:

Слайд 3

Использование различных микроорганизмов в качестве источников белка и витаминов обусловлено факторами:
а)

возможностью использования для культивирования микроорганизмов разнообразных химических соединений, в том числе отходов производств;
б) относительно несложной технологией производства микроорганизмов, которое может осуществляться круглогодично; возможностью его автоматизации;
в) высоким содержанием белка (до 60-70%) и витаминов, а также углеводов, липидов в микробиальных препаратах;
г) повышенным содержанием незаменимых аминокислот по сравнению с растительными белками;
д) возможностью направленного генетического влияния на химический состав микроорганизмов в целях совершенствования белковой и витаминной ценности продукта.

Слайд 4

1. Основанное на использовании живой или инактивированной биомассы микроорганизмов.
К ним

относится производство пекарских, винных и кормовых дрожжей, вакцин, белково-витаминных концентратов (БВК), средств защиты растений, заквасок для получения кисломолочных продуктов и силосования кормов, почвоудобрительных препаратов и др.;
2. Производящее продукты микробного биосинтеза, к числу которых относятся антибиотики, гормоны, ферменты, аминокислоты, витамины;
3. Основанное на получении продуктов брожения, гниения, (например, утилизация целлюлозы и различных отходов с целью получения углеводов, биогаза, биоэтанола). К ним же относятся получение спиртов, органических кислот, растворителей, а также биотехнология утилизации неприродных соединений.

Производство белка микроорганизмами можно разделить на три типа:

Слайд 5

Для получения белка одноклеточных микроорганизмов используют различные субстраты: парафины нефти, метан,

водород, метанол, этанол, уксусную кислоту, углекислый газ, молочную сыворотку, мелассу, крахмал и целлюлозосодержащие отходы промышленности и сельского хозяйства.
Для промышленного использования перспективными являются термофильные микроорганизмы, растущие при высоких (до +50 °С) температурах.
Благодаря некоторым бактериям микробиологическим способом производится ряд незаменимых аминокислот (глютаминовая кислота, лизин и др.), основная часть которых идет в пищевую промышленность и в животноводство.
На основе аминокислот готовят искусственные подсластители. Например, подсластитель метиловый эфир L-аспартил- L-фенилаланин в 150 раз слаще, чем глюкоза.

Слайд 6

В 1957г. Айзекс и Линдеман обнаружили, что клетки животных, инфицированных

вирусами, выделяют в сферу фактор, который способен вызывать у гентактных (не обработанных вирусом) клеток устойчивость у вирусной инфекции.
Этот фактор был назван интерфероном.
Интерферон относится к протеинам или гликопротеинам, в состав которых включено 146-166 аминокислотных остатков. Молекулярная масса – 20-80 кДальтон.

Биотехнология производства интерферона

Слайд 7

1. Обладает антивирусным действием - интерферон не действует на внеклеточный вирус,

а стимулирует образование интерлейкина-2, увеличивает синтез ферментов (эндонуклеазы - способны «разрезать» молекулы нуклеиновых кислот вирусов на уровне трансляции; и протеиназы).
2. Вызывает ингибирование клеточного роста (используется как противоопухолевое средство) – способен подавлять деление онкогенных клеток при сохранении функции активации всех звеньев иммунной системы.
3. Оказывает стимулирующее влияние на фагоцитоз, естественные клетки – киллеры и макрофаги; повышает неспецифическую резастентность клеток.

Эффекты интерферона

Слайд 8

4. Интерферон обладает антимикробной активностью
5. Оказывает радиозащитное действие.
6. Интерферон является

иммуномодулятором – т. е. регулирует иммунологические реакции, стимулирует иммунную систему организма.
Вырабатывается интерферон клетками позвоночных.
Наиболее активными продуцентами интерферона являются лимфоциты и макрофаги.
Наиболее активными индукторами среди вирусов являются вирус Ньюкаслской болезни, вирус Сендай, чумы свиней.

Слайд 9

1. Лейкоцитарный или α-IFN - получают в культуре лейкоцитов выделенных

из крови доноров.
Различают 20 рекомбинантных вариантов, отличающихся последовательностью аминокислот в полепептидной цепи и биологической активностью.
2. Фибробластный или β-IFN - для получения используют культуру фибрабластов.
3. Иммунный или γ-IFN - его синтезируют сенсебилизированные Т-лимфоциты при повторном контакте с мутогенами, а также с бактериальными и вирусными антигенами.
Все три класса интерферонов обладают различными физико-химическими свойствами и отличаются друг от друга серологически.

Классы интерферона

Слайд 10

1. Экзогенная – введение готового интерферона в организм, использование мазей,

содержащих интерферон.
2. Эндогенная – введение в организм индукторов интерферон, которые стимулируют процесс образования интерферона.
Наиболее активными индукторами интерферона являются синтетические и природные двунитевые РНК.

Виды интерферонизации

Слайд 11

1. Стимулируют фагоцитоз и биосинтез антител.
2. Тормозят рост и метастазирование

опухолей.
3. Проявляют антиклеточную активность.
4. Оказывают радиозащитное действие.
5. Увеличивают чувствительность клеток к действию интерферона.
6. Принимают участие в регуляции биосинтеза белка в клетке.

Механизм действия индукторов IFN

Слайд 12

1. Выделение иРНК, несущую информацию о структуре молекулы интерферона (РНК выделяют

после индукции синтеза интерферона);
2. Получение кДНК на матрице иРНК;
3. Встраивание кДНК в векторную плазмиду с участием ферментов рестриктаз и лигаз и получение рекомбинантной ДНК (рДНК), содержащей ДНК вектора с генетическими маркерами и ДНК, кодирующую синтез целевого продукта;
4. Трансформация рДНК в рецепиентную (пермиссивную) микробную клетку;

Биотехнология производства IFN (этапы)

Слайд 13

5.Получение клонов рекомбинантных продуцентов, способных синтезировать интерферон (на плотной питательной

среде);
6.Размножение клоновой культуры – продуцента в жидкой питательной среде;
7.Отделение клеток из культуральной жидкости центрифугированием;
8.Выделение целевых белков из нативного раствора или лизата биомассы продуцента, например, осаждением сульфатом аммония;

Слайд 14

9. Очистка интерферона после растворения осадка с помощью аффинной хроматографии

при использовании сорбента, связанного с моноклональными антителами к интерферону.
При пропускании раствора, содержащего целевой продукт и балластные вещества через колонку с иммуносорбентом происходит высокоспецифическое связывание антигена (интерферона) с моноклональными антителами к нему, все прочие вещества не задерживаются. Затем интерферон элюируют слабой кислотой, происходит диссоциация комплекса «антиген-антитело».
Для получения 60 мкг лейкоцитарного интерферона нужно 100 л крови или 1 л культуральной жидкости микроорганизма-рекомбинанта

Слайд 15

1. На основе сконструированных рекомбинантных ДНК, экспрессируемых в клетках E. coli

(α, β, α-IFN).
2. Возможен синтез химическим путем β и α- интерферона.
3. Повышение биосинтеза IFN возможно при введении в эукариотическую дрожжевую клетку вектора, на основе которого сконструирована рекомбинантная молекула ДНК с ионами β и α- интерферонов
4. Производство IFN с применением моноклональных антител к соответствующему IFN.

Другие способы получения интерферона:

Слайд 16

По характеру действия и клинической значимости препараты разделены на 4 основные

группы:
этиотропные, действующие на возбудителя заболевания;
иммуномодулирующие, корригирующие нарушение системы иммунитета, возникающие и развивающиеся в процессе болезни;
патогенетические, направленные на борьбу с интоксикацией, обезвоживанием, сосудистыми поражениями, органными нарушениями, аллергическими реакциями, а также на профилактику бактериальных осложнений;
симптоматические, купирующие сопутствующие симптомы заболевания (головная боль, бессонница, кашель и др.).

Слайд 17

Антивирусные средства делят на 4 группы:
химиопрепараты;
интерфероны;
индукторы ИНФ;
иммуномодуляторы.
Химиопрепараты – главным образом

средства этиотропной терапии.
ИНФ и их индукторы обладают комбинированным эффектом (этиотропным и иммуномодулирующим),
Иммуномодуляторы используются для иммунотерапии и иммунокоррекции.

Слайд 18

Применение интерферона имеет ряд преимуществ:
1. Широкий спектр действия, что очень важно

при терапии вирусных пневмоэнтеритов.
2. Действие интерферона обуславливается активацией естественных механизмов защиты организма на ранних стадиях инфекционного процесса.
3. Эффект проявляется сразу же после введения препарата.

Слайд 19

Применение интерферона имеет ряд недостатков:
Короткий период сохранения в организме (до 12ч.).

Препарат применяется в основном только парэнтерально.
Через 2-3 дня после применения интерферона наблюдается угнетение защитных функций иммунной системы, что может привести к быстрому размножению в организме условно-патогенной микрофлоры.
Возможны аллергические реакции при длительном применении.

Слайд 20

Интерлейкины.
Интерлейкины (ИЛ) – вещества белковой или гликопротеидной природы, синтезируемые преимущественно иммунокомпетентными

клетками.
В настоящее время выделено и охарактеризовано 15 интерлейкинов.
К интерлейкинам, играющим существенную роль в кооперативных взаимодействиях иммуно-компетентных клеток при развитии иммунного ответа, являются ИЛ 1, ИЛ 2, ИЛ 4, ИЛ 5, ИЛ 6.

Слайд 21

ИЛ 1 – цитокин, выделяемый макрофагами, стимулирующий функции Т и В-лимфоцитов.

С участием ИЛ 1 активируются Т-хелперы, синтезирующие ИЛ 2, а также β-лимфоциты, трансформирующиеся в плазматические клетки антителопродуценты. Он является посредником в обеспечении взаимодействия различных защитных противоинфекционных механизмов на уровне организма.
ИЛ 3 - цитокин, синтезируемый Т-лимфоцитами, стимулирует β-лимфоциты при гуморальном иммунном ответе и созревание Т-эффекторов в реакциях клеточного иммунного ответа. ИЛ 3 является ключевым фактором развития иммунного ответа.

Слайд 22

ИЛ 4 – фактор стимуляции В-клеток и части Т-лимфоцитов. Регулирует аллергические

реакции организма. С помощью ИЛ 4 Т-хелперы влияют на продукцию lgE в процессе развития иммунного ответа. Основными продуцентами ИЛ 4 являются нормальные Т-лимфоциты и Т-клеточные гибридомы.
ИЛ 5 – мультифункциональный цитокин, активирующий Т- и В-лимфоциты и эозинофилы; является продуктом активированных Т-лимфоцитов.
ИЛ 6 – один из ранних цитокинов, продуцируемый многими типами клеток (В-стимулирующий фактор, фактор роста гибридом/плазмоцитом, Т-лимфоцитактивирующий фактор), участвует в регуляции функций лимфоцитов, обладает противовирусным действием.

Слайд 23

В качестве продуцентов интерлейкинов используют:
культуры нормальных лимфоцитов или макрофагов;
клоны трансформированных

(опухолевых) клеток;
Т-клеточные гибридомы (продукты гибридизации опухолевых лимфоцитов, способных к нормальному росту и Т-клеток, синтезирующих определенный ИЛ;
рекомбинантные микробные клетки, полученные методами генной инженерии).

Биотехнологическое получение интерлейкинов

Слайд 24

Продуценты культивируют in vitro в сосудах определенного объема, затем ИЛ выделяют

из культуральной среды, концентрируют, очищают.
Для увеличения продукции ИЛ культуры клеток стимулируют митогенами (веществами, вызывающими митотическое деление клеток).
В качестве митогенов используют глобулярные растительные белки (фитогемаглютинин и др.), а также компонент клеточной стенки бактерий – мурамилдипептид.

Биотехнологическое получение интерлейкинов

Слайд 25

Для создания рекомбинантных микроорганизмов – продуцентов ИЛ:
-гены, контролирующие их синтез,

вводят в составе вектора в микробную клетку,
-выделяют и размножают клон рекомбинантов,
- культивируют полученный продуцент с целью накопления ИЛ.
В качестве рекомбинантных организмов используют клетки E.coli (ИЛ 1, ИЛ 2), дрожжи-сахаромицеты (ИЛ 2), причем дрожжи более удобны, т.к. клетки E.coli накапливают ИЛ внутриклеточно, а дрожжи выделяют в окружающую среду, следовательно, полученный продукт легче отделяется от клеток и очищается.

Биотехнологическое получение интерлейкинов

Слайд 26

Гормон роста:
обладает анаболическим действием,
повышает в клетках уровень биосинтетических

процессов,
усиливает биосинтез белков, ДНК, РНК и гликогена,
способствует мобилизации жиров из жировых депо и ускоряет распад высших жирных кислот и глюкозы,
повышает содержание в крови особых стимулирующих рост факторов – соматомединов.

Гормон роста

Слайд 27

При синтезе ДНК на мРНК гормона с последующим превращением ее в

двухнитиевую форму получается ген, кодирующий предшественник соматотропина, который расщепляется в бактериальных клетках с образованием активного гормона.
Этапы получения гормона роста
На первом этапе клонировали двухнитиевую ДНК-копию мРНК и расщеплением рестрикционными эндонуклеазами получили последовательность, которая кодирует всю аминокислотную последовательность гормона, за исключением первых 23 аминокислот.

Биотехнологическое получение гормона роста

Слайд 28

На втором этапе клонировали синтетический полинуклеотид, соответствующий аминокислотам от 1-й до

23-й.
На третьем этапе два полученных фрагмента объединили вместе, и «подстроили» к паре промоторов и участку связывания рибосом.
Конечный выход гормона составил 2,4 мкг на 1 мл культуры или 1 % от растворенных белковых клеток этого генетически сконструированного штамма E.coli.

Биотехнологическое получение гормона роста

Слайд 29

- Нарушение секреции инсулина вследствие деструкции β-клеток - абсолютная недостаточность инсулина

- является ключевым звеном патогенеза сахарного диабета 1-го типа.
- Нарушение действия инсулина на ткани - относительная инсулиновая недостаточность - имеет важное место в развитии сахарного диабета 2-го типа.
Число больных диабетом во всем мире составляет 130 млн. (2,5% населения).
Каждые 10-15 лет количество больных удваивается.
По оценке Международного института диабета (Австралия), к 2020 году в мире будет 320 млн. больных. В действительности число больных в 2-3 раза больше за счет скрытых недиагностированных форм.

Инсулин

Слайд 30

Инсулин человека можно производить четырьмя способами:
1) полным химическим синтезом;
2) экстракцией из

поджелудочных желез человека (оба способа не подходят из-за неэкономичности: недостаточной разработанности первого способа и недостатка сырья для массового производства вторым способом);
3) полусинтетическим методом с помощью ферментно-химической замены в положении 30 В-цепи аминокислоты аланина в свином инсулине на треонин;
4) биосинтетическим способом по генноинженерной технологии.
Два последних метода позволяют получить человеческий инсулин высокой степени очистки

Слайд 31

История открытия инсулина
вторая половина 19 века русский врач И.М. Соболев

доказал, что уровень сахара в крови человека регулируется специальным гормоном поджелудочной железы.
в 1922 году инсулин, выделенный из поджелудочной железы животного, был впервые введен десятилетнему мальчику, больному диабетом 1 типа.
1923 г. американская фирма «Eli Lilly» выпустила первый препарат животного инсулина.
в 1935 году датский исследователь Хагедорн оптимизировал действие инсулина в организме, предложив пролонгированный препарат.
в 1952 году были получены первые кристаллы инсулина.

Слайд 32

- в 1954 году английский биохимик Г.Сенджер расшифровал структуру инсулина.
К

концу 60-х годов развитие методов очистки гормона от других гормональных веществ и продуктов деградации инсулина позволили получить гомогенный инсулин, называемый однокомпонентным.
В начале 70-х г.г. А.Юдаевым и С. Швачкиным был предложен химический синтез инсулина, однако осуществление данного синтеза в промышленном масштабе было дорогостоящим и нерентабельным.
В 80- годах достижения молекулярной биологии позволили синтезировать с помощью E.coli обе цепи человеческого инсулина, которые были затем соединены в молекулу биологически активного гормона
в начале 90-х г. в Институте биоорганической химии РАН получен рекомбинантный инсулин с использованием генно-инженерных штаммов E.coli.

Слайд 33

I. Выделение инсулина из животного сырья
Получение инсулина состоит из ряда стадий:
1.

Измельчение замороженных поджелудочных желез и экстракция кислым спиртовым раствором.
2. Осаждение балластных белков и освобождение от липидов.
3. Изоэлектрическое осаждение фракций инсулина (при pH=5,5) и осаждение спиртом, ацетоном, эфиром.
4. Очистка инсулина: осаждение солями, фракционирование методами хроматографии, гель-фильтрации.
5. Осаждение инсулина в виде кристаллов.
6. Переосаждение цинк-инсулина.

Слайд 34

1. замороженные поджелудочные железы измельчают в мясорубке-волчанке;
2. экстрагируют способом бисмацерации

1,5-4 часа при постоянном перемешивании (первый раз 80-85 % этанолом в реакторе с мешалкой, второй раз экстрагируют 57% этанолом, который подкислен ортофосфорной кислотой (хлороводородной или серной) до значения pH 2,8-3).
Подкисленный спирт способствует инактивации фермента трипсина, находящегося в поджелудочной железе, благодаря чему удается сохранить инсулин в неизменном состоянии.
На Минском заводе эндокринных препаратов используют роторно-пульсационный аппарат для экстракции, что дает интенсивность экстрагирования и сокращает время до 1,5ч.

Слайд 35

3. Полученные вытяжки объединяют, отставляют на холоде на 48 ч для

освобождения от нежелательных белков, которые выпадают в осадок.
4. Осадок отделяют центрифугированием и удаляют.
5. Для выделения и очистки инсулина применяют ионообменную хроматографию. Осуществляют сорбцию инсулина из прозрачной жидкости на макропористом сульфокатионите КУ-33-30/100 при значении pH 3,0-3,3 в режиме псевдоожижения.
6. Жир удаляют путем промывки катионита 65-67% этанолом, а балластные белки 0,3М раствором ацетатного буфера.

Слайд 36

7. Десорбцию инсулина осуществляют с помощью 0,01-0,05 раствора аммонийного буфера (pH

10) и немедленно подкисляют хлороводородной кислотой до pH 4,5 и добавляют ацетон.
8. Выпавший осадок балластных веществ удаляют.
9. Инсулин осаждают раств. цинка-ацитата (pH 6,2).
10. Полученный цинк-инсулин очищают методом кристаллизации, после чего растворяют в воде, подкисленной до pH 2,8 лимонной кислотой. Раствор отстаивают 1ч.
11. Выпавшие балластные вещества удаляют фильтрацией через кизельгур.
12. Фильтрат смешивают с ацетоном, добавляют хлористый цинк и охлажденный до 0ºС фенол.

Слайд 37

13. Для медленной кристаллизации инсулина создают условия с последовательным изменением pH

раствора:
раствор подщелачивают до pH 8,5; оставляют на 2-3 мин;
изменяют pH до 6,8 и перемешивают 1 ч;
при значении pH 6,5 перемешивают 2 ч;
при pH 6,2 и 6,0 перемешивают 2 ч и отстаивают 20ч;
при значении pH 5,8 перемешивают 2ч;
отстаивают 96 ч при температуре 5 °С.
14. Выпавшие кристаллы инсулина отделяют центрифугированием, промывают на воронке Бюхнера последовательно холодной водой, ацетоном, эфиром.
15. Досушивание проводят на воздухе, в вытяжном шкафу и эксикаторе.

Слайд 38

II.Создание промышленного производства генно-инженерного инсулина.
Технология разработана совместно с немецкой фирмой

Genbiotech GmbH (Гейдельберг) в 1987—1989 гг.
Процесс был основан на продуцировании генноинженерным штаммом Е. coli рекомбинантного белка (молекулярная масса около 17000 Да), содержащего лидерную аминокислотную последовательность, соединенную через аминокислотный остаток метионина с проинсулином человека.

Слайд 39

Технологическая схема включала в себя стадии:
Схема 1:
1. Ферментация (выращивание штамма-продуцента в

ферментере).
2. Отделение биомассы.
3. Разрушение клеток с выделением телец включения.
4. Очистка рекомбинантного белка (2 садии)
- ионообменной хроматографией на DEAE-сефарозе FF
- гель-фильтрацией на сефадексе G-25M.
5. Расщепление рекомбинантного белка бромцианом.
6. Окислительный сульфитолиз проинсулина.

Слайд 40

7. Хроматографическая очистка гексасульфоната проинсулина (3 стадии):
гель-фильтрацией на Сефадексе G-50 F,

ионообменной хроматографией на DEAE-сефарозе FF
гель-фильтрацией на сефадексе G-25M).
8. Ренатурация проинсулина.
9. Хроматографическая очистка нативного проинсулина ионообменной хроматографией на DEAE-сефарозе FF.
10. Ферментативное расщепление проинсулина.
11. Хроматографическая очистка инсулина:
- ионообменная хроматография на S-сефарозе FF,
- ультрафильтрация,
- гель-фильтрация на сефадексе G-50 SG.
12. Лиофильная сушка Na-соли инсулина человека.

Слайд 41

Технологическая схема включала в себя стадии:
Схема 2 (с 2012 г.):
1. Получение

посевного материала штамма-продуцента
1.1. Оживление консервированной культуры.
1.2. Выращивание маточной культуры.
1.3. Выращивание инокулята.
2. Биосинтез гибридного белка
2.1. Выращивание продуцента в ферментере (ферментация).
2.2. Получение биомассы (сепарирование).
2.3. Дезинтеграция клеточной суспензии.
2.4. Выделение и отмывка телец включения (центрифугирование).

Слайд 42

Технологическая схема включала в себя стадии:
Схема 2 (с 2012 г.):
3. Выделение

и очистка рекомбинантного белка
3.1. Солюбилизация телец включения и восстановление рекомбинантного белка.
3.2. Ренатурация рекомбинантного белка.
3.3. Хроматографическая очистка рекомбинантного белка.
4. Ферментативное расщепление рекомбинантного белка
5. Хроматографическая очистка инсулина 1
6. Хроматографическая очистка инсулина 2
7. Хроматографическая очистка инсулина 3
8. Получение кристаллического инсулина

Слайд 43

В основе процесса биосинтеза — использование штамма-продуцента Е. coli JM 109

с рекомбинантной плазмидой pPINS 07.
Рекомбинантная плазмидная ДНК содержит искусственный ген, кодирующий гибридный полипептид, состоящийиз:
одного IgG-связывающего домена белка А из Staphylococcus aureus,
пептидного линкера His6GlySerArg,
и проинсулина человека.
Плазмида (5051 п. о.) содержит в качестве маркера ген β- лактамазы (устойчивости к ампициллину).
Экспрессия рекомбинантного белка индуцируется изопропил- β-D-тиогалактозидом и достигает 30% от суммарного клеточного белка.

Слайд 44

1. Клетки продуцента рекомбинантного препроинсулина человека отделяют сепарированием, дезинтегрируют при высоком

давлении для сбора телец включения, многократно отмывают полученные тельца включения от водорастворимых белков и иных клеточных компонентов.
За 1 цикл получают 15—25 кг влажных телец включения, содержащих более 13% рекомбинантного белка.
2. Полученные тельца включения солюбилизируют в буферном растворе, содержащем мочевину и дитиотреитол (ДТТ) для восстановления внутри- и межмолекулярных ди-сульфидных связей в рекомбинантном белке.
3. Восстановленный рекомбинантный белок подвергают воздействию кислорода воздуха при сильном разбавлении, при этом белок окисляется с образованием дисульфидных связей, соответствующих нативной конформации инсулина (рефолдинг). Происходит ренатурация рекомбинантного белка.

Слайд 45

4. Ренатурированный рекомбинантный белок очищают ионообменной хроматографией.
5. Белок подвергают ферментативному расщеплению

трипсином и карбокси-пептидазой Б в массовом соотношении 4000 : 2 : 1.
6. После осаждения и предварительной обработки получают инсулин-сырец 86—88%-ной чистоты.
7. Очистка.
- На первой стадии очистки гидрофобной хроматографией содержание инсулина достигает 96%,
на второй стадии очистки ионообменной хроматографией проводится окончательное освобождение от иммуногенных фракций,

Слайд 46

финишная гель-фильтрация проходит в стерильных условиях и позволяет довести качество препарата

до фармакопейного.
7. В завершении процесса получают кристаллический цинк-инсулин, который высушивают до необходимой степени влажности.
Выход продукта составляет не менее 100 г с 1000 л культуральной жидкости штамма-продуцента.
Преимущества процесса:
одностадийная очистка ренатурированного рекомбинантного белка;
совместное ферментативное расщепление рекомбинантного белка трипсином и карбоксипептидазой Б;
эффективное использование хроматографии низкого давления для очистки инсулина.

Слайд 47

Требования к качеству субстанции инсулина человека изложены в соответствующих разделах Американской

Фармакопеи (Ф. США) и Европейской Фармакопеи (ЕФ).
Инсулин должен быть охарактеризован качественно.
Первый показатель определяется методом ВЭЖХ в сравнении со стандартом, сравнением хроматографических профилей инсулина и инсулина-стандарта, расщепленных специфическим ферментом на 4 фрагмента («метод пептидных карт») и определением биоидентичности (in vivo, на кроликах, по сравнительному содержанию глюкозы в крови).
Количественное определение проводится также методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Количество гормона принято оценивать в международных единицах (ME), при этом 1 ME (IU) = 0,0347 мг инсулина.

Получение белка в биотехнологическом производстве

Содержание

Дрожжи.Бактерии.ВодорослиГрибы.Основные продуценты белка используемые в фарм. биотехнологическом производстве:

Использование различных микроорганизмов в качестве источников белка и витаминов обусловлено факторами:а)

1. Основанное на использовании живой или инактивированной биомассы микроорганизмов. К ним

Для получения белка одноклеточных микроорганизмов используют различные субстраты: парафины нефти, метан,

В 1957г. Айзекс и Линдеман обнаружили, что клетки животных, инфицированных

1. Обладает антивирусным действием - интерферон не действует на внеклеточный вирус,

4. Интерферон обладает антимикробной активностью5. Оказывает радиозащитное действие.6. Интерферон является

1. Лейкоцитарный или α-IFN - получают в культуре лейкоцитов выделенных

1. Экзогенная – введение готового интерферона в организм, использование мазей,

1. Стимулируют фагоцитоз и биосинтез антител.2. Тормозят рост и метастазирование

1. Выделение иРНК, несущую информацию о структуре молекулы интерферона (РНК выделяют

5.Получение клонов рекомбинантных продуцентов, способных синтезировать интерферон (на плотной питательной

9. Очистка интерферона после растворения осадка с помощью аффинной хроматографии

1. На основе сконструированных рекомбинантных ДНК, экспрессируемых в клетках E. coli

По характеру действия и клинической значимости препараты разделены на 4 основные

Антивирусные средства делят на 4 группы:химиопрепараты; интерфероны;индукторы ИНФ;иммуномодуляторы.Химиопрепараты – главным образом

Применение интерферона имеет ряд преимуществ:1. Широкий спектр действия, что очень важно

Применение интерферона имеет ряд недостатков:Короткий период сохранения в организме (до 12ч.).

Интерлейкины.Интерлейкины (ИЛ) – вещества белковой или гликопротеидной природы, синтезируемые преимущественно иммунокомпетентными

ИЛ 1 – цитокин, выделяемый макрофагами, стимулирующий функции Т и В-лимфоцитов.

ИЛ 4 – фактор стимуляции В-клеток и части Т-лимфоцитов. Регулирует аллергические

В качестве продуцентов интерлейкинов используют:культуры нормальных лимфоцитов или макрофагов; клоны трансформированных

Продуценты культивируют in vitro в сосудах определенного объема, затем ИЛ выделяют

Для создания рекомбинантных микроорганизмов – продуцентов ИЛ: -гены, контролирующие их синтез,

Гормон роста: обладает анаболическим действием, повышает в клетках уровень биосинтетических

При синтезе ДНК на мРНК гормона с последующим превращением ее в

На втором этапе клонировали синтетический полинуклеотид, соответствующий аминокислотам от 1-й до

- Нарушение секреции инсулина вследствие деструкции β-клеток - абсолютная недостаточность инсулина

Инсулин человека можно производить четырьмя способами:1) полным химическим синтезом;2) экстракцией из

История открытия инсулина вторая половина 19 века русский врач И.М. Соболев

- в 1954 году английский биохимик Г.Сенджер расшифровал структуру инсулина. К

I. Выделение инсулина из животного сырьяПолучение инсулина состоит из ряда стадий:1.

1. замороженные поджелудочные железы измельчают в мясорубке-волчанке; 2. экстрагируют способом бисмацерации

3. Полученные вытяжки объединяют, отставляют на холоде на 48 ч для

7. Десорбцию инсулина осуществляют с помощью 0,01-0,05 раствора аммонийного буфера (pH

13. Для медленной кристаллизации инсулина создают условия с последовательным изменением pH

II.Создание промышленного производства генно-инженерного инсулина. Технология разработана совместно с немецкой фирмой

Технологическая схема включала в себя стадии:Схема 1:1. Ферментация (выращивание штамма-продуцента в

7. Хроматографическая очистка гексасульфоната проинсулина (3 стадии):гель-фильтрацией на Сефадексе G-50 F,

Технологическая схема включала в себя стадии:Схема 2 (с 2012 г.):1. Получение

Технологическая схема включала в себя стадии:Схема 2 (с 2012 г.):3. Выделение

В основе процесса биосинтеза — использование штамма-продуцента Е. coli JM 109

1. Клетки продуцента рекомбинантного препроинсулина человека отделяют сепарированием, дезинтегрируют при высоком

4. Ренатурированный рекомбинантный белок очищают ионообменной хроматографией.5. Белок подвергают ферментативному расщеплению

финишная гель-фильтрация проходит в стерильных условиях и позволяет довести качество препарата

Требования к качеству субстанции инсулина человека изложены в соответствующих разделах Американской

Похожие презентации

Дрожжи.
Бактерии.
Водоросли
Грибы.
Основные продуценты белка используемые в фарм. биотехнологическом производстве:

Использование различных микроорганизмов в качестве источников белка и витаминов обусловлено факторами:
а)

1. Основанное на использовании живой или инактивированной биомассы микроорганизмов.
К ним

4. Интерферон обладает антимикробной активностью
5. Оказывает радиозащитное действие.
6. Интерферон является

1. Стимулируют фагоцитоз и биосинтез антител.
2. Тормозят рост и метастазирование

Антивирусные средства делят на 4 группы:
химиопрепараты;
интерфероны;
индукторы ИНФ;
иммуномодуляторы.
Химиопрепараты – главным образом

Применение интерферона имеет ряд преимуществ:
1. Широкий спектр действия, что очень важно

Применение интерферона имеет ряд недостатков:
Короткий период сохранения в организме (до 12ч.).

Интерлейкины.
Интерлейкины (ИЛ) – вещества белковой или гликопротеидной природы, синтезируемые преимущественно иммунокомпетентными

В качестве продуцентов интерлейкинов используют:
культуры нормальных лимфоцитов или макрофагов;
клоны трансформированных

Для создания рекомбинантных микроорганизмов – продуцентов ИЛ:
-гены, контролирующие их синтез,

Гормон роста:
обладает анаболическим действием,
повышает в клетках уровень биосинтетических

Инсулин человека можно производить четырьмя способами:
1) полным химическим синтезом;
2) экстракцией из

История открытия инсулина
вторая половина 19 века русский врач И.М. Соболев

- в 1954 году английский биохимик Г.Сенджер расшифровал структуру инсулина.
К

I. Выделение инсулина из животного сырья
Получение инсулина состоит из ряда стадий:
1.

1. замороженные поджелудочные железы измельчают в мясорубке-волчанке;
2. экстрагируют способом бисмацерации

II.Создание промышленного производства генно-инженерного инсулина.
Технология разработана совместно с немецкой фирмой

Технологическая схема включала в себя стадии:
Схема 1:
1. Ферментация (выращивание штамма-продуцента в

7. Хроматографическая очистка гексасульфоната проинсулина (3 стадии):
гель-фильтрацией на Сефадексе G-50 F,

Технологическая схема включала в себя стадии:
Схема 2 (с 2012 г.):
1. Получение

Технологическая схема включала в себя стадии:
Схема 2 (с 2012 г.):
3. Выделение

4. Ренатурированный рекомбинантный белок очищают ионообменной хроматографией.
5. Белок подвергают ферментативному расщеплению