Блок “Молекулярна біотехнологія”. Генетична модифікація рослин

економічні та юридичні аспекти
3. Сучасний стан проблеми в світі
4. Методи детекції ГМ у зразках
5. Методи генетичної модифікації рослин
5.1. Векторні системи
5.2. Методи доставки чужорідної ДНК
5.3. Управління експресією рослинних генів
5.4. Сучасні методи редагування рослинних геномів

– це рослини, генетичний матеріал яких було змінено методами генетичної інженерії.
Це один із варіантів ГМО – генетично модифікованих організмів.
Трансгенні
Цисгенні
Субгенні
Генетичні модифікації

В геном рослин вноситься генетичний матеріал інших видів (навіть інших царств живого).

В геном рослин вноситься генетичний матеріал з рослин того ж або близького виду.

Чужорідний генетичний матеріал не вноситься, натомість модифікується власний геном рослин.

Н-д: Гени Bt забезпе-чують стійкість до комах

+

створено першу ГМ-культуру – резистентний до антибіотиків табак (N. tabacum).

1986 р. – перші польові дослідження ГМР у США та Франції (резистентний до гербіцидів табак).
1987 р. – у Бельгії компанією Plant Genetic Systems створено резистентний до комах табак.
1992 р. – у Китаї вперше дозволили комерційне вирощування ГМ табаку (вірус-резистентного).
1994 р. – у США дозволено продаж ГМ томатів FlavrSavr, а в ЄС дозволено вирощування та продаж ГМ табаку стійкого до гербіцидів.
1995 р. – масове ліцензування Bt-рослин (сої, картоплі, бавовни) в США – перші рослини, що були здатні продукувати пестициди.

Bt введено у рослину

Bt-рослини

FlavrSavr томати

Золотий рис

2013 р. – Роберт Фрелі, Марк ван Монтегю та Марі-Дель Чілтон отримали престижну премію World Food Prize “за покращення якості, кількості та доступності їжі в світі”.

“Innate” картопля

р. – IRRI створив золотий рис із підвищеним вмістом β-каротину.

Розповсюдження дефіциту вітаміну А у світі

2005 р. – дослідниками із Syngenta створено “золотий рис 2” із в 23 рази вищим вмістом β-каротину.
Модифікація:
Внесено два гени біосинтезу β-каротину:
1. psy (фітоїнсинтаза) із нарциса.
2. crtl (каротиндесатураза) із бактерії
Erwinia uredovora.

Дослідження показали, що β-каротин із золотого рису ефективно засвоюється, а сама рослина не наносить шкоди здоров’ю [Goodman & Wise, 2006; Tang et al., 2009; 2012]

р. – акт вандалізму проти золотого рису на Філіппінах.
2016 р. – відкритий лист до GreenPeace від Нобелівських лауреатів.

ГМР вирощуються у 28 країнах. Ще у 34 країнах дозволено імпорт ГМ продуктів. Ще 11 країн дозволили проведення польових досліджень ГМР.
Топ-5 країн із найбільшими обсягами вирощування ГМР: США (понад 70 млн.га), Бразилія (>40 млн.га), Аргентина (>24 млн.га), Індія (11 млн.га), Канада (~ 11 млн.га)

скорпіонову отруту

Їстівні вакцини

Сині троянди

“Arctic apples”

Інсулін-продукуючі рослини

істотно відрізняється в різних країнах.
Станом на 2015 р. вирощування та продаж ГМР заборонені у 38 країнах (з них 19 – Європа; у тому числі – в Україні). У 63 країнах (28 з ЄС) біотехнологічне використання ГМР дозволено. Сумарно в усіх країнах було прийнято понад 1000 законодавчих актів стосовно обігу та використання ГМП.

У 64 країнах маркування є обов’язковим при частці ГМ >0,9%

Типовий анти-ГМО постер

в Україні введено вимогу про обов’язкове маркування всієї харчової продукції написом “без ГМО” або “з ГМО”.
2012 – здійснено спробу оптимізації законодавства про маркування продуктів відповідно до світової практики. Законопроект не було ухвалено.
● Жодний ГМО в Україні поки не зареєстрований.
● Ввезення та обіг ГМО і продукції з ГМО в Україні по факту заборонені.
Основний нормативно-правовий акт - Закон України “Про державну систему біобезпеки при створенні, випробуванні, транспортуванні та використанні генетично модифікованих організмів” №1103 від 31.05.2007.

11

інтеграції чужорідної ДНК в хромосомну ДНК рослини

Промотор

Термінатор

Цільовий ген

Геном рослини-хазяїна

Успішно інтегрована в геном конструкція

Цільова вставка

Варіанти детекції

Базується на визначенні модифікованих /внесених нуклеотидних (частіше) або амінокислотних послідовностей (рідше). Найчастіше застосовуються методи кількісної ПЛР у реальному часі (qRT-PCR), мультиплексної ПЛР та ELISA.
Є три основних варіанти детекції – елемент-специфічна, конструкт-специфічна та подієспецифічна.

12

ПЛР дозволяє ідентифікувати одразу декілька трансгенів у зразку за рахунок використання одразу кількох наборів гено-специфічних праймерів.

Первинні АТ

+ Цільовий білок

+ Вторинні АТ

Детекція сигналу

Стрептавідин

+ Біотин-фермент

Фермент

Субстрат

Продукт

Для детекції білкових продуктів чужорідного походження використовується метод ELISA

Метод “сендвіч” ELISA для детекції ГМП

Чужорідний/ змінений білок

Метод мультиплексної ПЛР для детекції внесених/модифікованих генів

Продукти різного розміру

Праймери до мішені 1

Праймери до мішені 2

Праймери до мішені 3

Праймери до мішені 4

Green

ДНК-полімераза

qRT-PCR із використанням
барвника SYBR-Green

qRT-PCR із використанням
сиквенс-специфічних зондів

Недоліки сучасних методів:
● Неможливо встановити попередньо невідомі модифікації
● Тривалість та коштовність процедури
● Низька продуктивність аналізів

Дволанцюгова ДНК

Одноланцюгова ДНК

Зонд

ДНК-Пол.

Праймер

Гасник

Репортер

модифікують найчастіше: соя, кукурудза, бавовна. Також – картопля, цукровий буряк, папайя, гарбуз, ріпак (CANOLA), табак, троянди, баклажани, альфальфа. ГМ пшениця не вирощується в жодній з країн.

Підвищений термін зберігання

Стійкість до вірусних інфекцій

Стійкість до антибіотиків та гербіцидів

Стійкість до шкідників

Стійкість до абіотичних стресових чинників

Покращені харчові якості

Біоремедіаційні властивості

Здатність продукувати цільові продукти (рослини-біореактори)

Н-д: FlavrSavr, Arctic apples

Н-д: DroughtGard кукурудза

Н-д: Bt-рослини, Desiree-картопля

Н-д: золотий рис, банани Кавендіша, нетоксична маніока

Н-д: CANOLA, терапевтичні рослини

Н-д: соя, бавовна, кукурудза тощо.

Н-д: Картопля рез. до Y-вірусу

Н-д: ГМ Thlaspi caerulescens

4 курс

За останні 20 років був ряд голосних справ, що негативно вплинули на репутацію ГМ продуктів:
1) Справа Пустаї (1999) – споживання ГМ картоплі нібито призводило до стоншення стінки кишечника та послаблення імунітету в щурів.
2) Справа Bt-кукурудзи (2011) – заявлено, що використання такої ГМ кукурудзи призводило до накопичення пестициду Bt в організмах жінок та ембріонів.
3) Справа Сераліні (2007-2014) – споживання ГМ кукурудзи нібито призводило до ураження печінки, нирок та серця у щурів.

сьогодні існують генетичні модифікації понад 150 видів рослин. ГМ дозволяє суттєво скоротити затрати часу/грошей на створення нових сортів.

1. Тотипотентність клітин

3. Наявність клітинної стінки і пластид

2. Майже 80% наявних геномів рослин просеквеновано за останні 5 років
Перші просеквеновані геноми – рис, тополя, виноград (лише 3 геноми до 2007 року!)

стінка слугує істотною перешкодою для трансформації, тому часто працюють із протопластами.

бактерія, що є рослинним патогеном та в ході свого життєвого циклу генетично модифікує рослини, спричиняючи ріст пухлин (Ti – tumor inducing) шийки кореня.

оперони vir-генів

Гени катаболізму опінів

Лівий край

Правий край

Гени ауксинів

Гени цитокінінів

Гени опінів

Т-ДНК
(10-30 kbp)

Пухлина шийки кореня

Корінь

Місце пошкодження

Рослина

iaaM
iaaH

A.tumefaciens

tmr
(ipt)

Ti-плазміда

Повтори

як векторів:
1) Містять зайві гени ауксинів, цитокінінів та опінів;
2) Великий розмір плазмід (200-800 kbp);
3) Не можуть використовуватись в клітинах E.coli та ряду інших бактерій;
4) Інколи відбувається інтеграція зайвого фрагмента ДНК за лівим краєм.
Методами генетичної інженерії створено рекомбінантні вектори на основі Ті-плазміди.

Правий край

ori (E.coli /+ A.tumefaciens)

Полілінкер

Селективний маркер
(Н-д: npt)

Лівий край

“Кілерний” ген

Місце для вставки

Через відсутність vir-генів потрібні особливі стратегії доставки рекомбінантних плазмід у рослинні клітини.

плазміди – основна (несе цільову вставку) та допоміжна (сприяє інтеграції в геном рослини). Всі початкові етапи клонування проводяться в клітинах E.coli, після чого плазміда переноситься в клітини агробактерій, що містять дефектну Ті-плазміду.

Лівий край

Правий край

Цільовий ген

Ген селективного маркера для E.coli та A.tumefacies

Ген селективного маркера для рослин

Основна плазміда

Дефектна хелперна плазміда

ori A.tumefaciens

оперони vir-генів

По суті, основна плазміда є човниковим вектором.

попередню, але в даному випадку відбувається фізичне об’єднання окремих векторів.

Рекомбінація

Правий край

Лівий край

оперони vir-генів

оперони vir-генів

Лівий край

Гомологічні послідовності

“Обеззброєна” плазміда

Коінтегруюча плазміда

Правий край

Цільовий ген

Селект.маркер для рослин

Селект.маркер для бактерій

Цільовий ген

Селект.маркер для бактерій

Селект.маркер для рослин

Рекомбінантна Ті-плазміда

дещо завеликими для зручної роботи в умовах in vitro, окрім того через великі розміри у них мало унікальних сайтів рестрикції.
Модифікація – створення міні-векторів.

Міні-бінарний вектор pCB301
(3,5 kbp)

Пр.край

Полілінкер

Лів.край

(Селективний маркер)

pBIN19
(11,8 kbp)

Полілінкер

Пр.край

Лів.край

Селект.
маркер

Дизайнерські елементи:
P35S та T35S – промотор і термінатор із вірусу мозаїки цвітної капусти.
TP – послідовність, що направляє білок у мітохондрії або пластиди.

на мікрочастинки (0,4-1,2 мкм) золота або вольфраму, які за допомогою спец.приладу – “генної гармати” – вистрілюють ся (V = 300-600 м/с) в рослинний матеріал.

Гелій

Стерильний листок / калюс

Вакуумна камера

Гальмівний екран

Шар із мікрочастинками

“Літаючий” диск

Диск виверження

Схема біолістичного приладу

Основний недолік: внесення ДНК відбувається у випадкові місця.

суспензії клітин, калюсні культури, цілі тканини, пилок тощо. На відміну від Ті-плазмідного методу працює для однодольних рослин. Дозволяє навіть вносити ДНК в органели.

Цільовий ген

Сел.маркер рослин 1

Сел.маркер рослин 2

Сел.маркер дріжджів 2

Сел.маркер дріжджів 1

p

p

p

p

p

t

t

t

t

t

Вектор на основі YAC

Bt-кукурудзу створено за допомогою біолістичного методу

Прилад для in situ біолістики

висока напруга (100-200В), що призводить до формування тимчасових гідрофільних пор у мембранах.

Мембрана

Цільові гени

Тимчасові пори

Пори закриваються, ДНК опиняється всередині

Схема виділення протопластів

Протопласти табаку

50-100 хлоропластів, у кожному з яких міститься 10-100 копій кільцевої ДНК.
Є два основних варіанти внесення генетично модифікованих продуктів у хлоропласти:
1) Введення чуж.генів безпосередньо у геном хлоропластів;
2) Введення чуж.генів (злитих) у ядерний геном .

Вектор для інтеграції ген.матеріалу в геном хлоропластів

Елементи хлоропластної ДНК

Ген Spcr

Цільовий ген

Цільовий ген

Промотор

5’-НТД

3’-НТД

Рекомбінантна транскрипційна касета хлоропластного гена

☺Хлоропласти спадкуються виключно по лінії жіночої статі, що унеможливлює нецільове поширення

продукт, який легко піддається ідентифікації. В окремих випадках продукти репортерних генів можна ідентифікувати навіть in situ.
GFP (та його модифікації) є ідеальним репортером, оскільки потребує лише УФ-світла для візуалізації.

конститутивними слабкими промоторами (н-д: промотор 35S вірусу мозаїки цвітної капусти), тоді як зараз відомо і створено цілу низку сильних регульованих промоторів.

Рослинна ДНК

Рослинна ДНК

Правий край

Правий край

А - Ідентифікація конститутивних промоторів

В - Ідентифікація регульованих промоторів

Приклад “дизайнерського” промотора

5’

3’

Промотор

Енхансери (2-7)

Ген-мішень

5’-НТД

3’-НТД

рекомбінація відбувається суттєво рідше, ніж у тварин чи прокаріотів. Показано, що надекспресія дріжджового гена RAD54 підвищує частоту успішних генних модифікацій на два порядки.
RAD54 посилює процеси інтеграції чужорідної ДНА в геном рослини, а також суттєво посилює репаративну здатність клітин. Трансформанти по цьому гену мають високу толерантнісь до іонізуючого випромінювання – селективний маркер.

Ген-мішень

Правий край

Правий край

Лівий край

Лівий край

Селективний маркер

Селективний маркер

А – Конструкція для внесення гена RAD54;
В – Конструкція із цільовою вставкою.

– 2016, 4 курс

Використання сучасних конструйованих нуклеаз відкриває цілком нові можливості в генетичні модифікації рослин.
Ці нуклеази є високоспецифічними та піддаються тонкому налаштуванню. Внесені ними модифікації є перманентними, на відміну від попередніх підходів, таких як РНК-інтерференція.
Мегануклеази
ZFN
CRISPR/Cas
TALENs

Новітні інженерні нуклеази

Zn-finger nucleases

Ефекторні нуклеази подібні до транскрипційних активаторів

Згруповані регулярно розділені короткі паліндромні повтори / асоційовані гени

в природі, оскільки вони роспізнають сайти розміром 12-40 bp. Є дві основні родини: інтронні ендонуклеази та інтеїнові ендонуклеази.

Кодуються мобільними генетичними елементами у археїв, бактерій, фагів, грибів, дріжджів, водоростей і деяких рослин.
Поширені представники: I-Scel, I-Crel, I-Dmol.
Підходи до створення нових мегануклеаз:
1) Зміна специфічності існуючих мегануклеаз;
2) Створення химерних ферментів.
Недолік: обмежений репертуар ферментів, низька ймовірність знайти фермент, специфчний до цільової послідовності

ZFN складається з двох функціональних доменів – ДНК-зв’язуючого (містить Zn-пальці) та нуклеазного.
Переваги: мутації є перманентними і спадковими; працює із великим діапазоном клітин; не потрібно селект.маркерів для скринінгу; швидка інтеграція в / руйнування цільових ділянок геному; ефективність до 20%.

ДНК-зв’язуючий домен

Нуклеазний домен

Розпізнавання ціл.сайту та гетеродимеризація

Ядро

ZFN робить 2-ланц. розріз і дисоціює з ДНК

Шаблон для репарації вноситься разом із парою ZFNs. Вик-ся гомол. рекомбінація.
1-20% клітин містить вставку гена.

Шаблон для репарації відсутній; Вик-ся негомол. Поєднання кінців.
1-20% клітин містить делецію гена

Пара нуклеаз вноситься методом електропорації, трансфекції тощо.

Застосування:
- Повний нокаут генів;
- Створення knock-in ліній;

4 курс

Це рестрикційні ендонуклеази із бактерій роду Xanthomonas, що утворюються шляхом злиття TAL-ефекторного ДНК-зв’язуючого домену із нуклеазним доменом. Потенційно здатні розпізнавати будь-який цільовий сайт.
Механізм аналогічний до ZFNs – внесення 2л розриву із подальшою репарацією за типом HR або NHEJ.
Це найбільш вживаний із новітніх методів для ГМ рослин. Н-д, так створено сою із покращеним профілем олій. TALENs приблизно у 200 р. більш коштовні за CRISPR/Cas.

TALE та цільового сайту

Zn-finger arrays

завжди супроводжується втратою кількох п.о., а інколи і цілих генів.

2016, 4 курс

Функція системи – у адаптивній імунності бактерій (40%) та археїв (90%). Всього ідентифіковано 3 типи CRISPR/Cas механізмів, з них тип ІІ вивчено найкраще – потребує лише одного Cas-білка.

Печериця – перший харчовий продукт, модифікований CRIPSR/Cas (2015)

2016, 4 курс

Це найбільш “дружня” з усіх систем точного редагування геномів. Ефективність методу надзвичайно висока – інколи сягає 70%. Специфічність системи залежить від crRNA / gRNA; їм можна задавати будь-які послідовності.

wtCas9

Cas9 D10A

dCas9