Генетика бактерий

фундаментальными свойствами всех живых организмов. Они обеспечивают постоянство и многообразие видов и являются основой эволюции живой природы.
Единицей наследственности является ген -- участок ДНК, в котором зашифрована последовательность аминокислот в полипептидной цепочке, контролирующая отдельный признак особи.
Совокупность генов, сосредоточенных в «хромосоме» бактерий называется генотип.
Геном – совокупность наследственного материала определенного вида организмов. У подавляющего числа прокариот геном представлен одиночной хромосомой, которая является кольцевой молекулой ДНК. Помимо хромосомы, в клетках бактерий часто находятся плазмиды — также замкнутые в кольцо ДНК, способные к независимой репликации. Хромосомная ДНК и плазмиды вместе называются репликоны -- генетические элементы, способные самостоятельно реплицироваться.

Основные понятия и термины

как хромосомы, так и плазмид. Например, геном спирохеты Borrelia burgdorferi, вызывающей болезнь Лайма, состоит из линейной хромосомы и нескольких плазмид, часть из которых имеет также линейное строение.
Геномы большинства прокариот маленькие и компактные, гены плотно упакованы и между ними находится минимальное количество регуляторной ДНК. Геномы почти всех эубактерий и архей содержат от 106 до 107 пар нуклеотидов и кодируют 1000-4000 генов. Многие гены у прокариот организованы в совместно транскрибируемые группы — опероны.
Самыми маленькими геномами у прокариот обладают внутриклеточные симбионты и паразиты, такие как Hodgkinia cicadicola (144 Кб), Carsonella rudii (180 Кб) или Mycoplasma genitalium (580 Кб). Самым большим прокариотическим геномом является геном обитающей в почве бактерии Sorangium cellulosum, размер которого составляет около 13 Мб.

Основные понятия и термины

потенциал организма, а фенотип – реализацию генетических возможностей в конкретных условиях среды. Фенотипические изменения не наследуются.
Различные формы одного и того же гена называются аллелями (lac+ и lac-).
Изменение генотипа происходит в процессе мутаций – стойких (спонтанных или индицированных) изменений генома).
NB! Геном – вся совокупность наследственной информации, а генотип – та ее часть, которая кодирует определенные признаки.

вызвавшего ее фактора:
лабильные модификации (краткосрочные) – сохраняются только в первых генерациях после прекращения действия фактора;
стабильные модификации (сохраняются во многих поколениях).

NB! Важно понимать отличие стабильных форм фенотипической изменчивости от генетической.
Фенотипические изменения не затрагивают геном, но находятся под его контролем. Генотип определяет и контролирует диапазон фенотипической изменчивости.

vs.

E.сoli на агаре МакКонки: lac+ и lac- штаммы

Диссоциация колоний Bacillus anthracis на разных средах

формы клеток, образование L-форм,
культуральные – изменения культуральных свойств (например, диссоциация на R- и S-колонии), образование пигментов в зависимости от состава среды или аэрации,
биохимические – синтез фермента в условиях наличия определенного субстрата (cтафилококки только в присутствии пенициллина синтезируют фермент пенициллиназу),
вирулентные – отсутствие факторов вирулентности W и V у Yersinia pestis при 28C,
антигенные -- проявляются сменой антигенов микроорганизмов в ходе инфекционного за­болевания в результате включения «молчащих» генов (без их перестройки). К модификациям такого рода относятся изменения антигенной структуры гонококка, трепонемы си­филиса, боррелий возвратного тифа, холерного вибриона.

молекулярную массу 1,7х109-2,8х109 дальтон,
включает 3х106-5х106 пар оснований,
имеет гаплоидный (одинарный) набор генов,
расположена в цитоплазме клетки в многократно свернутом и плотно упакованном виде,
содержит гены, обуславливающие жизненно-важные для бактерий признаки.

* -- типично, но не обязательно

+ фосфат = нуклеотид

Фосфаты
обычно присоединяются к пентозе вместо гидроксильной группы при 5’ атоме углерода.
Фосфат придает нуклеотиду отрицательный заряд.
Нуклеотиды соединяются друг с другом в цепочку

ДНК всегда «считывается» в определённом направлении.

Правило Чаргаффа: количество аденина равно количеству тимина, а кол-во гуанина – кол-ву цитозина.

Содержание Г+Ц в ДНК бактерий (%) постоянная величина для вида бактерий, используется в таксономии

специальных ферментов двойная спираль материнской ДНК расплетается на две нити, на каждой образовавшейся нити достраивается вторая нить, образуя две идентичных дочерних молекулы ДНК, которые затем скручиваются в отдельные спирали.
В ходе последующего деления материнской клетки каждая дочерняя клетка получает по одной копии молекулы ДНК, которая является идентичной ДНК исходной материнской клетки. Этот процесс обеспечивает точную передачу генетической информации из поколения в поколение.

с матрицы ДНК на информационную (или матричную) РНК
II этап – трансляция
«перевод информации» с матричной РНК в рибосомах в последовательность аминокислот в полипептидной цепи.

Белок – это отдельный полипептидный комплекс
нескольких полипептидов, выполняющий
биологическую функцию
•Полипептид - понятие химическое.
•Белок - понятие биологическое.

III этап – биогенез белков
пространственная сборка, химическая или структурная модификация, транспорт белков

Из 4х азотистых оснований -- 64 кодона:
61 – кодируют аминокислоты и 3 стоп-кодона

в биосинтезе белка у прокариот участвует > 300
макромолекул (до 35% сухого веса клетки E.coli)

молекулы РНК. Процесс транскрипции (букв. переписывания, переложения – англ.) осуществляет фермент РНК-полимераза.
Последовательность событий транскрипции:
инициация – связывание РНК-полимеразы с ДНК, расплетание цепи в нужном участке;
элонгация - синтез матричной РНК на матричной цепи ДНК согласно принципу комплиментарности;
терминация – отсоединения РНК-полимеразы.
Особенности:
РНК-транскрипт имеет ну же последовательность, что и участок кодирующей (смысловой) цепи ДНК,
в РНК тимин заменяется на урацил.

Транскрипция

кодирующая цепь

Существует множество ингибиторов транскрипции, большинство из них – антибиотики, например:
рифамицин (и его производное рифампицин) это ингибиторы инициации,
актиномицин Д прочно связывается с ДНК и препятствует транскрипции.

– аминокислоты,
5 – большая субъединица рибосомы,
6 – растущая полипептидная цепь

6

Трансляция

Также раздедяют на:
инициацию — узнавание рибосомой стартового кодона и начало синтеза,
элонгацию — собственно синтез белка,
терминацию — узнавание терминирующего кодона (стоп-кодона) и отделение продукта.

связи между организмами для построения естественной классификации), в настоящее время, составляет геносистематика. Она основывается на изучении и сравнительном анализе геномов организмов.
Изучение последовательности нуклеотидов в различных фрагментах или целом геном осуществляется с помощью секвенирования.
Для того, чтобы установить «буквенную» последовательность генов – интересующий фрагмент ДНК заданной длины нужно «размножить» в достаточном количестве, чтобы сделать возможной его детекцию.
Именно для многократного «копирования» и служит метод ПЦР.

течение 30-40 сек.
2. Ожиг - присоединение праймеров. Происходит комплементарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического участка. Для разных праймеров – своя температура отжига (50-65оС).
3. Элонгация - достраивание цепей ДНК. Комплементарное достраивание цепей ДНК происходит от 5’-конца к 3’-концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров.
Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (дНТФ). Процесс синтеза катализируется ферментом термостабильной ДНК-полимеразой (Taq-полимеразой) и проходит при температуре 70-72оС. Время протекания синтеза 20-40 сек.
Вновь синтезированная ДНК – является матрицей для второго и последующего циков.

Прежде чем анализировать нуклеотидные последовательности – их необходимо многократно копировать (амплифицировать), чтобы накопить достаточное количество ДНК для детектирования (из одной ДНК за 30-40 циклов ПЦР можно получить до 108 ампликонов).

образует с двухцепочечными фрагментами ДНК прочные соединения, которые под действием УФ-облучения способны флуоресцировать: после окрашивания гелевой пластинки можно наблюдать оранжево-красные светящиеся полосы.

Сравнение с полосками известной длины (так называемыми ладдерами) позволяет оценить длину полученных фрагментов. Также можно вырезать интересующую полоску геля и выделить из нее интересующую ДНК.

(естественные)
индуцированные (экспериментальные).
по широте охвата:
геномные – изменяется количество хромосом,
хромосомные – нарушается строение хромосом (делеции, инверсии, дубликации),
генные – нарушаются последовательности пуриновых и пиримидиновых оснований в ДНК в пределах одного гена, если речь о замене одно нуклеотида – это точечные мутации.
По направлению:
прямые – из дикого типа в мутантный,
обратные – из мутантного типа обратно в дикий (на два порядке реже возникают):
истинные обратные – восстанавливается и фенотип, и генотип дикого типа,
супрессорные обратные – восстанавливается только фенотип.

ИК-излучение);
Химические
некоторые алкалоиды: колхицин — один из самых распространённых в селекции мутагенов, винкамин, подофиллотоксин;
окислители и восстановители (нитраты, азотистая кислота и её соли — нитриты, активные формы кислорода);
алкилирующие агенты (например, иодацетамид, эпоксибензантрацен);
нитропроизводные мочевины: нитрозометилмочевина, нитрозоэтилмочевина, нитрозодиметилмочевина — часто применяются в сельском хозяйстве;
этиленимин, этилметансульфонат, диметилсульфат, 1,4-бисдиазоацетилбутан (известный как ДАБ);
некоторые пестициды (пестициды группы альдрина, гексахлоран);
некоторые пищевые добавки (например, ароматические углеводороды (бензол и т.п.), цикламаты);
продукты переработки нефти;
органические растворители;
лекарственные препараты (например, цитостатики, препараты ртути, иммунодепрессанты).
Биологические:
специфические последовательности ДНК — транспозоны;
некоторые вирусы (вирус кори, краснухи, гриппа);
продукты обмена веществ (продукты окисления липидов);
антигены некоторых микроорганизмов.

встраивается фрагмент ДНК другой бактерии (донора);
возникают новые последовательности в результате перестроений (разрывов, вставок, соединений) исходной молекулы ДНК;
происходят вследствие процессов трансформации, конъюгации, трансдукции;
бывают законные и незаконные:

эукариотических клеток – этот явление трансфекции.
К трансформации способны многие бактерии, например, Streptococcus, Haemophilus, Bacillus, актиномицеты, цианобактерии и другие бактерии. Так, антигенная вариация, наблюдаемая у возбудителя гонореи Neisseria gonorrhoeae, обеспечивается за счёт трансформации, при которой клетки передают друг другу гены различных вариантов пилей, за счёт которых прикрепляются к клеткам организма-хозяина.
В нормальном состоянии проникновению крупных молекул ДНК внутрь бактериальных клеток мешают плотные покровы, поэтому, чтобы быть способной к трансформации, клетка должна войти в так называемое состояние компетентности. В естественных условиях компетентность приобретает часть культуры в логарифмической фазе роста под действием некоторых белков (факторов компетентности).
Развитие компетентности в лог-фазе обусловлено нехваткой питательных веществ и накоплением значительного количества факторов компетентности. Трансформацию могут провоцировать бактериофаги, вызывающие выход ДНК из погибающих клеток, а также повреждения бактериальной ДНК. Приобретение компетентности — чрезвычайно сложный физиологический процесс, у Bacillus subtilis он требует экспрессии около 40 генов.
Сначала компетентные клетки связывают ДНК своей поверхностью с помощью особых рецепторов, причём линейными фрагментами клетка трансформируется гораздо легче, чем кольцевыми. ДНК расщепляется нуклеазами до фрагментов с массой до 4—5 миллионов Да, причём в клетку поступает лишь одна из двух цепей фрагментов. Некоторые бактерии, такие как пневмококки и Bacillus subtilis, могут поглощать ДНК из разнообразных источников, а другие, такие как Haemophilus, могут поглощать только ДНК клеток своего вида. Фрагменты, имеющие массу менее 500 кДа, в клетку не попадают.
После попадания в клетку одноцепочечный фрагмент встраивается в геномную ДНК клетки-реципиента. Трансформация длится от 10 до 30 минут и у разных бактерий происходит с частотой около 1 %.

генов, расположенных вблизи встраивания фага) или неспецифическая (случайный захват бактериальных генов);
лизогения – носительство бактерией профага (фага, встроенного в геном);
лизогенная конверсия – приобретение новых свойств благодаря интеграции умеренного фага в хромосому бактерии.

сама F-плазмида, и имеет гомологию с некоторыми капсидными белками фагов. Плазмиды могут являться потомками некоторых вирусов, приспособившихся к персистированию в клетках хозяев.

перемещаться из одного места в другое

это мобильные участки ДНК организмов, способные к передвижению (транспозиции) и размножению в пределах генома, т.н. «прыгающие гены»

небольшие молекулы ДНК, физически обособленные от хромосом и способные к автономной репликации, главным образом, у бактерий и архей.

встраиваются в хромосому бактерий в определенном участке, при делении клетки реплицируются вместе с ней и переходят в дочерние клетки

меньше массы хромосомы. Несут 40-50 генов. Необязательные компоненты клеток, но могут кодировать новые признаки, которые обеспечат выживание клона бактерий в изменившихся условиях среды. Конъюгативные – передаются с помощью конъюгации, неконъюгативные – способны самостоятельно проникать в клетку. В цитоплазме бактерий плазмиды способны к самостоятельной репликации, также могут интегрировать в бактериальную хромосому, обмениваться генетическим материалом друг с другом и с ДНК клетки-хозяина.