Методы секвенирования ДНК

Июль 27, 2022

Главная
Биология
Методы секвенирования ДНК

Содержание

2. Немного истории 1977 г. - Первый полный геном бактериофага Φ-X174 (5386 нуклеотидов) секвенирован методом Shotgun 1995
3. «Расшифровка» генома Розеттский камень Характерные размеры геномов вирус папиллом человека - 8 т.п.о Escherichia coli -
4. Секвенирование по Максаму-Гилберту Химическая деградация ДНК
5. Реакция Сэнгера – не ПЦР, а многократный синтез с одной матрицы Секвенирование методом Сэнгера
6. 96-capillary ABI 3730XL Первое поколение секвенаторов - капиллярные Нанофор 05 – российская модель
7. Начало проекта по секвенированию эукариотического генома А) Выбор объекта Б) Подробная биологическая характеристика объекта, изучение его
8. Стратегия секвенирования генома человека 1) 23 хромосомы человека – 23 подпроекта по каждой 2) Субклонирование больших
9. Упрощённая схема процесса секвенирования генома методом Shotgun Ферментативные методы фрагментации неприменимы для протяжённых районов. Необходима комбинация
10. Подробнее Используемые векторы – ранее М13 phagemid Вентер – производная pBR322, Говорун - pCR2.1 (Invitrogen) Лейшмания
11. 1998г. – старт проекта секвенирования первого индивидуального генома человека. Крейг Вентер, компания «Celera Genomics» Использование метода
12. Schook et al., 2005 Схема организации геномного проекта на примере генома свиньи (2.6 Gb) А) Секвенирование
13. Phred 10 = 90% точность, Phred 20 = 99%, Phred 30 = 99,9%, Phred quality score
14. Примеры ошибок и их соотнесение с Phred Компрессия Проскальзывание полимеразы Химерная последовательность - начало конец
15. Основную часть ДНК в эукариотических геномах составляют повторы. Это делает крайне затруднительным правильное ассемблирование одиночных последовательностей
16. Зависимость числа и длины контигов от покрытия Разрывы в контигах образуются и по чисто статистическим причинам.
17. Нелинейность в выборе оптимальных параметров Shotgun Изменения в степени покрытия (%) для 16-kb района при 3-х
18. Этапы биоинформатического анализа Собственно сборка секвенированных последовательностей в геном. Структурная аннотация, включающая : идентификацию различных элементов
19. Революция цены в геномных исследованиях 454 GS20 1000 Геномов SOLiD 3.0 Illumina GA2
21. Скачать презентацию

Слайд 2

Немного истории
1977 г. - Первый полный геном бактериофага Φ-X174 (5386

нуклеотидов) секвенирован методом Shotgun
1995 г. – секвенирование генома первого свободноживущего организма – бактерии Haemophilus influenzae.
Проект «Геном человека» - 1990 – 2003 - 2006 гг., стоимость -15 млрд.$.
Секвенировано 92,3% генома.
2010 г. – завершён проект «тысяча геномов», для каждого персонального генома человека секвенировано около 85% последовательности.

1995 2000 2005 2010

Слайд 3

«Расшифровка» генома
Розеттский камень
Характерные размеры геномов
вирус папиллом человека - 8 т.п.о
Escherichia coli

- 4900 т.п.о
Saccharomyces cerevisiae – 12 млн п.о.
Arabidopsis thaliana – 101 млн.п.о
Triticum aestivum – 16 млрд. п.о.
Человек – 3 млрд.п.о.

Слайд 4

Секвенирование по Максаму-Гилберту
Химическая деградация ДНК

Слайд 5

Реакция Сэнгера – не ПЦР, а
многократный синтез с одной матрицы

Секвенирование методом Сэнгера

Слайд 6

96-capillary ABI 3730XL
Первое поколение секвенаторов - капиллярные
Нанофор 05 – российская модель

Слайд 7

Начало проекта по секвенированию эукариотического генома
А) Выбор объекта
Б) Подробная биологическая характеристика

объекта, изучение его жизненного цикла, их особенностей, отбор варианта для получения и поддерживания материала.
В) Подробное кариотипирование.
С) Выбор стратегии секвенирования

Слайд 8

Стратегия секвенирования генома человека
1) 23 хромосомы человека – 23 подпроекта по

каждой
2) Субклонирование больших фрагментов генома в BAC-библиотеках встройки 40 000 – 200 000 b.p. (YAC, дрожжевые – до 1 Mb, Cosmid, фаговые – до 45 kb). Суммарно получено 22,000 BAC - клона
3) отдельный Shotgun для каждого клона BAC (40 000 – 200 000 b.p.).

Проект «Геном человека» - 1990 – 2003 - 2006 гг., стоимость – от 3 до 15 млрд.$.
Секвенировано 92,3% генома.

Слайд 9

Упрощённая схема процесса секвенирования генома методом Shotgun
Ферментативные методы фрагментации неприменимы

для протяжённых районов.

Необходима комбинация библиотек с различным размером встроек.

Необходим высокопрофессиональный биоинформатический анализ.

Слайд 10

Подробнее
Используемые векторы – ранее М13 phagemid
Вентер – производная pBR322,
Говорун -

pCR2.1 (Invitrogen)
Лейшмания - pUC18
Для больших встроек (30-40 kb) – fosmid vektor pCC1FOS

Слайд 11

1998г. – старт проекта секвенирования первого индивидуального генома человека. Крейг Вентер,

компания «Celera Genomics»
Использование метода Shotgun без предварительного деления генома на фракции
Преимущественно для бактерий и эукариот с малым геномом (простейшие, грибы).
Набор библиотек – обычно 2, 10, 50, редко до 150 kb
Геном Wenter’a – библиотеки со встройками 2 000 – 300 000 b.p.
Два варианта организации работы – только shotgun с покрытием по геному 6-7 х. Бык – 6х, собака – 7.6х, лошадь – 6.8х, слон 7х etc.
Сочетание shotgun и pair-mate библиотек пиросеквенатора Roche.
Кошка – 2х, кролик – 2х, тупайя – 2х, серый лемур 2х etc.

Whole genome shotgun

Слайд 12

Schook et al., 2005
Схема организации геномного проекта на примере генома свиньи

(2.6 Gb)

А) Секвенирование транскриптома
Б) Секвенирование Shotgun-библиотек с расчётным 3х покрытием, использование библиотек с встройками 3 kb, 10 kb и 50 kb
В) Создание и секвенирование ВАС-библиотек с расчётным 3х покрытием
С) Комбинирование данных при биоинформатическом анализе

Слайд 13

Phred 10 = 90% точность, Phred 20 = 99%, Phred 30

= 99,9%,

Phred quality score

Слайд 14

Примеры ошибок и их соотнесение с Phred
Компрессия Проскальзывание полимеразы
Химерная

последовательность - начало конец

Слайд 15

Основную часть ДНК в эукариотических геномах составляют повторы. Это делает крайне

затруднительным правильное ассемблирование одиночных последовательностей в длинные геномные контиги.

ДНК не является случайной последовательностью.

Часть последовательностей ДНК выпадает при клонировании/секвенировании, образуя не заполняемые разрывы (gap).

Слайд 16

Зависимость числа и длины контигов от покрытия
Разрывы в контигах образуются и

по чисто статистическим причинам.

Слайд 17

Нелинейность в выборе оптимальных параметров Shotgun
Изменения в степени покрытия (%) для

16-kb района при 3-х кратном покрытии (48 kb суммарных данных) для различных величин клонированных встроек

Для экономии средств в ходе проекта необходим корректный выбор среднего размера встроек. Кроме того, стремление к максимальной длине прочтения в ущерб количеству прочтений может оказать строго обратный эффект.

Для проекта секвенирования генома лейшмании (35 Mb) [Laurentino et al., 2004] библиотекой на основе pUC18 со встройкой 2 kb покрыто 15% генома

Слайд 18

Этапы биоинформатического анализа
Собственно сборка секвенированных последовательностей в геном.
Структурная аннотация, включающая :
идентификацию

различных элементов генома
выявление ORF и их локализация в определённых районах
определение экзон-интронной структуры генов, их кодирующих районов и вариантов транскрипции/сплайсинга
локализация регуляторных районов гена
Функциональная аннотация: связь различных районов генома с их биологической функцией, в том числе с биохимическими процессами, заболеваниями, регуляторными процессами в организме в целом и т.п.
Подтверждение сходства физической карты хромосом и взаимного расположения контигов\скаффолдов

Слайд 19

Методы секвенирования ДНК

Содержание

Немного истории 1977 г. - Первый полный геном бактериофага Φ-X174 (5386

«Расшифровка» геномаРозеттский каменьХарактерные размеры геномоввирус папиллом человека - 8 т.п.оEscherichia coli

Секвенирование по Максаму-ГилбертуХимическая деградация ДНК

Реакция Сэнгера – не ПЦР, а многократный синтез с одной матрицы

96-capillary ABI 3730XLПервое поколение секвенаторов - капиллярныеНанофор 05 – российская модель

Начало проекта по секвенированию эукариотического геномаА) Выбор объектаБ) Подробная биологическая характеристика

Стратегия секвенирования генома человека1) 23 хромосомы человека – 23 подпроекта по

Упрощённая схема процесса секвенирования генома методом Shotgun Ферментативные методы фрагментации неприменимы

ПодробнееИспользуемые векторы – ранее М13 phagemidВентер – производная pBR322, Говорун -

1998г. – старт проекта секвенирования первого индивидуального генома человека. Крейг Вентер,

Schook et al., 2005Схема организации геномного проекта на примере генома свиньи

Phred 10 = 90% точность, Phred 20 = 99%, Phred 30

Примеры ошибок и их соотнесение с Phred Компрессия Проскальзывание полимеразыХимерная