Молекулярная генетика онтогенеза

Июль 28, 2022

Главная
Биология
Молекулярная генетика онтогенеза

Содержание

2. Стволовые клетки
3. Стволовые клетки (история) 1908: российским ученым Александром Максимовым предсказано существование СК (им же введен этот термин).
4. Тератокарциномы – ключ к обнаружению стволовых клеток Тератокарциномы – злокачественные тератомы, которые содержат как дифференцирующиеся ткани,
5. Свойства тератокарциномных клеток - Неоднородный состав клеток - Аномалии кариотипа - Легко культивируются и гибридизуются -
6. Получение химер из клеток тератокарциномы Химера Бластоциста
7. Получение эмбриональных стволовых клеток Классический метод (М. Эванс и М. Кауфман, 1981 г.): Источник - ВКМ
8. Вид бластоцисты под электронным микроскопом
9. Тотипотентность (totipotency) [лат. totus — весь, целый и potentia — сила] — способность клетки дифференцироваться в
10. Основные свойства ЭСК 1) Плюрипотентность (тотипотентность?) 2) Нормальный кариотип 3) Самоподдержание в культуре (иммортальность ) 4)
11. Изоферменты щелочной фосфатазы, транскрипционные факторы Oct-4, Nanog, теломеразная активность, маркеры клеточной поверхности: SSEA-3, SSEA-4 – антигенные
13. Гаплоидные эмбриональные стволовые клетки — ЭС клетки с гаплоидным набором хромосом. Сочетают в себе преимущества гаплоидии
14. Гаплоидные половые клетки из ЭСК В 2003 г. из эмбриональных стволовых клеток получены полноценные мышиные ооциты
15. Андрогенные гаплоидные ЭСК (AhаESC) Получение – перенос сперматозоида в энуклеированный ооцит, развитие ооцита до бластоцисты, выделение
16. Strategies to generate offspring with PhaESCs and AhaESC. ооцит ооцит зигота
17. Эмбриональные стволовые клетки – подобие раковых клеток Недифференцированные клетки; Способность к долговременному делению; Высокая теломеразная активность;
18. Искусственная дифференцировка клеток ВКМ бластоцисты в трофобласты Трофобластные СК ES клетки Дифференциирующиеся трофобластные клетки
19. Опухолевые стволовые клетки — немногочисленные специфические долгоживущие и медленно пролиферирующие опухолевые клетки, способные при трансплантации иммунодефицитным
20. а - Эмбриоидные тела б - Начало миграции клеток из эмбриоидного тела и их дифференцировки Начальные
21. Дифференцировка ЭСК человека под действие различных факторов роста
22. Дорзоморфин 89% клеток дифференциируют по нейрональному пути hESC
23. Ниша стволовых клеток
24. Ниша стволовых клеток в волосяном фолликуле 1 - стволовые клетки наружного волосяного влагалища ниже сальной железы;
25. цитоплазма ядро транскрипция Молекулярный механизм поддержания «стволовости» ЭСК в семенниках дрозофилы
26. Ключевые факторы транскрипции, поддерживающие «стволовость» ЭСК Oct-4 – Присутствует в ЭСК, эктодерме гаструлы, примордиальных (первичных) зародышевых
27. Основные назначения «ниши» для стволовых клеток ограничение пролиферации стволовых клеток только необходимостью поддержи-вать тканевой гомеостаз; 2)
28. Региональные стволовые клетки Региональные стволовые клетки
29. Мезенхимальные стволовые клетки Ведут свое происхождение от зародышевого листка мезенхимы. Содержатся в костном мозге, надкостнице, жировой
30. Гемопоэтические стволовые клетки — плюрипотентные кроветворные стволовые клетки, которые способны многократно делиться и дифференцироваться во все
31. Нейрональные стволовые клетки - Мультипотентные клетки, которые способны многократно делиться и дифференцироваться во все классы нейрональных
32. Маркеры региональных стволовых клеток Стволовые клетки Белок-маркер Стволовые нейрональные клетки Нестин, Sur8 Начало специализации нейрональных клеток-предшественников
33. Использование стволовых клеток в исследовательских целях и в медицине Направленная дифференцировка
34. Перечень заболеваний, при лечении которых в отдельных случаях была успешно применена трансплантация стволовых клеток Основное внимание
35. В глазу человека обнаружены особые стволовые клетки, которые не только способны превращаться в высокочувствительные к свету
36. Индукция плюрипотентности в фибробластах с помощью ретровирусных конструкций, содержащих гены: 4 фактора: Oct3/4, Sox2, c-Myc, Klf4
37. Ретровирусы Аденовирусы Вальпроевая к-та Варианты получения iPS клеток 0,01% 0,1% 0,001% Ретровирусы Использование рекомбинантных белков
38. Ген c-myc – ключевой для получения полноценных iPS Тест с химерными мышами показал, что 3F-iPSC (отсутствие
39. Дальнейшее развитие метода 1) Использование белков (2011). 2) Химически индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, ХИПСК (смесь из
40. Cочетание трех небольших соединений (форсколина, основного фактора роста фибробластов и ингибитора фермента киназы гликогенсинтазы-3 GSK-3beta )
41. Белок Oct-4 – играет ключевую роль в самообновлении недифференцированных эмбриональных стволовых клеток. Клетки кожи с введенным
42. Спектр белков, с которым взаимодействуют коровые транскрипционные факторы в ЭСК
43. Три основных способа получения плюрипотентных стволовых клеток из соматических клеток
44. Трансгеноз, трансгенез (transgenesis) [лат. trans(ferre) — переносить и греч. genes(is) — происхождение] — искусственный перенос экзогенной
45. Инъекция ДНК в один из пронуклеусов зиготы Имплантация инъецированной зиготы в приемную мать Псевдобеременная самка Тестирование
46. Зигота человека Зигота свиньи
48. Из истории микроинъекций Т. Лин, середина 60-х годов – первые микроинъекции веществ в яйцеклетку мыши Гермерад,
49. 1. Приемы переноса генов с помощью вирусов SV-40 и MoMLV (Р. Яниш, Б. Минц с 1974
50. Перенос вирусов в с/х животных Salter, 1987 – куры (вирус лейкемии птиц) Narvey, 1990 – овцы
51. Схема переноса генов с использованием ретровирусных векторов Культуральная среда
52. Получение трансгенных мышей с использованием ретровирусного вектора 8-клеточный эмбрион Самка-донор Рекомбинантный ретровирус Трансген Инфицирование и имплантация
53. Трансфекция сперматозоидов: липофекция, использование диметилсульфоксида и др Трансгеноз с помощью сперматозоидов
54. Bracket et al., 1971 – захват спермиями чужеродной ДНК Lavitrano et al., 1989 – трансгенная мышь
55. Способы трансгеноза Микроинъекция в пронуклеусы зигот или ядра эмбрионов, электро-порация, баллистическая трансфекция Фрагменты ДНК Техника переноса
56. Эмпирически подобранные условия для наиболее эффективного получения трансгенных организмов (мышей) с помощью микроинъекций Для инъекций удобен
57. На сегодняшний день: 1 трансгенная мышь из 10-40 инъецированных зигот 1 трансгенная корова из 1600 инъецированных
58. Трансмитохондриальный организм (trans-mitochondrial organism) — животный организм, содержащий в своих клетках митохондрии другого организма, который получают
60. «Ребенок от трёх родителей» - Митохондриальные болезни встречаются у 1 из 6500 детей. - Описано около
62. Цисгеноз (сisgenesis) — процесс получения генетически-модифицированных организмов, основанный на методах генной инженерии, при котором в отличие
63. Паратрансгеноз (paratransgenesis) [лат. para — возле, при, вне, trans(ferre) — переносить и греч. genesis — происхождение]
64. -- Изучение функции генов - Изучение механизмов регуляции экспрессии генов (ткане – и стадиеспецифическая экспрессия) -
66. Скачать презентацию

Слайд 2

Стволовые клетки

Слайд 3

Стволовые клетки (история)
1908: российским ученым Александром Максимовым предсказано существование СК (им

же введен этот термин).
1960-е гг.: Тератокарциномы. Термин “эмбриональная плюрипотентная клетка” ввел Лерой Стивенс.
1963-1968: Э. Маккаллох и Дж. Тилл показали присутствие самообновляющихся клеток в костном мозге мыши (пересадка, фокусы в селезенке). Доказана возможность восстановления кроветворения у реципиента (человека) после трансплантации костного мозга.
1970: А. Фриденштейн выделил мезенхимные стволовые клетки.
1978: в пуповинной крови человека обнаружены гемопоэтические стволовые клетки.
1981: М. Эвансом и М. Кауфманом из бластоцисты получены ЭСК мыши (Нобелевская премия за 2007 г.). Термин ЭСК.
1998: Дж. Томпсоном получены ЭСК человека (одно из 3-х лучших достижений биологии XX века).

Слайд 4

Тератокарциномы – ключ к обнаружению стволовых клеток
Тератокарциномы – злокачественные тератомы, которые

содержат как дифференцирующиеся ткани, так и плюрипотентные стволовые опухолевые клетки (тератомы – доброкачественные опухоли, состоящие из дифференцированных тканей и остатков зачатков органов).
Стволовые тератокарциномные клетки принято называть эмбриональными карциномными клетками и обозначать их буквами ЕС или ЕСС (embryonal carcinoma cells).

Слайд 5

Свойства тератокарциномных клеток
- Неоднородный состав клеток
- Аномалии кариотипа
- Легко культивируются и

гибридизуются
- Образуют солидные тератокарциномы при введении под кожу и асцидные тератокарциномы при внутрибрюшинном введении
- Трудности получения химер с полноценными половыми клетками
- Потенции к опухолеобразованию у химер не реализуются

Слайд 6

Получение химер из клеток тератокарциномы
Химера
Бластоциста

Слайд 7

Получение эмбриональных стволовых клеток
Классический метод (М. Эванс и М. Кауфман,

1981 г.):
Источник - ВКМ естественной бластоцисты
Среда – та же, как для роста тератокарциномных клеток
Добавки – фидерный слой (эмбриональные фибробласты) или LIF – leukemia inhibitory factor; bFGF (человек)
Дополнение (Ш. Миталипов, 2013 г.):
Перенос ядра соматической клетки человека в яйцеклетку, получение искусственной бластоцисты (кофеин – задержка преждевременного деления). Далее, по классической схеме.

Слайд 8

Вид бластоцисты под электронным микроскопом

Слайд 9

Тотипотентность (totipotency) [лат. totus — весь, целый и potentia — сила]

— способность клетки дифференцироваться в любой тип клеток организма, включая экстраэмбриональные (напр., зигота, ранние эмбрионы, клетки внутренней клеточной массы бластоциста и др.). При определенных условиях тотипотентная клетка способна дать начало созданию целого организма.
Плюрипотентность (pluripotency) [лат. plures — многие и potentia — сила, мощь] — способность клетки дифференциироваться во множество специализированных типов клеток, включая герминальную линию, но не в экстраэмбриональные клетки.
Мультипотентность (multipotency) [лат. multum — много и potentia — сила, мощь] — способность клетки дифференцироваться в разные типы зрелых клеток одного вида ткани; напр., обладающие мультипотентностью нервные стволовые клетки способны производить в организме три типа клеток: нейроны, астроциты и олигодендроциты.

Слайд 10

Основные свойства ЭСК
1) Плюрипотентность (тотипотентность?)
2) Нормальный кариотип
3) Самоподдержание

в культуре (иммортальность )
4) Гипометилирование ДНК
5) Высокая теломеразная активность
6) Короткая G1-фаза
7) Наличие специфических молекулярных маркеров
8) Отсутствие маркеров дифференцировки
9) Экспрессия генов, продукты которых необходимы для поддержания «стволовости» и дальнейших стадий развития
10) Синхронное и асинхронное деления
11) Существуют в основном на ранних стадиях развития
(у взрослого организма – в основном региональные СК).

Слайд 11

Изоферменты щелочной фосфатазы, транскрипционные факторы Oct-4, Nanog, теломеразная активность, маркеры клеточной

поверхности: SSEA-3, SSEA-4 – антигенные детерминанты (эпитопы) гликолипидов и TRA-1-60, TRA-1-81 – разные эпитопы одного протеогликана клеточной поверхности.

Классические маркеры ЭСК

Слайд 12

Слайд 13

Гаплоидные эмбриональные стволовые клетки — ЭС клетки с гаплоидным набором хромосом.

Сочетают в себе преимущества гаплоидии и плюрипотентности и служат в качестве уникальной системы для генетического анализа молекулярных, клеточных и онтогенетических событий. Впервые такие клетки млекопитающих (мышь) с использованием партеногенеза (активация неоплодотворенных ооцитов 5% этанолом) получены М. Либом (M. Leeb) и А. Вутцем (A. Wutz) в 2011 г. Обозначение - PhaESC

Слайд 14

Гаплоидные половые клетки
из ЭСК
В 2003 г. из эмбриональных стволовых клеток получены

полноценные мышиные ооциты
В 2016 г. из эмбриональных стволовых клеток получены полноценные мышиные сперматид-подобные клетки

Слайд 15

Андрогенные гаплоидные ЭСК (AhаESC)
Получение – перенос сперматозоида в энуклеированный ооцит, развитие

ооцита до бластоцисты, выделение ВКМ.
Инъекции AhаЭСК в ооциты – химеры.

Слайд 16

Strategies to generate offspring with PhaESCs and AhaESC.
ооцит
ооцит
зигота

Слайд 17

Эмбриональные стволовые клетки – подобие раковых клеток
Недифференцированные клетки;
Способность к долговременному делению;
Высокая

теломеразная активность;
Вызывают опухоли при внутрибрюшинной пересадке.

Дифференцировочная терапия – один из путей лечения рака

Слайд 18

Искусственная дифференцировка клеток ВКМ бластоцисты в трофобласты
Трофобластные СК
ES клетки
Дифференциирующиеся трофобластные клетки

Слайд 19

Опухолевые стволовые клетки — немногочисленные специфические долгоживущие и медленно пролиферирующие опухолевые

клетки, способные при трансплантации иммунодефицитным животным in vivo индуцировать рост опухоли, идентичной исходной, в то время как другие короткоживущие и более дифференцированные клетки опухоли этой способностью не обладают. О.с.к. обладают способностью к самовоспроизведению и асинхронному делению, когда одна дочерняя клетка сохраняет свойства О.с.к., а вторая становится коммитированной к дифференцировке в определенном направлении и способна быстро пролиферировать, но способность к дифференцировке у ее потомков изменена.
Новое в терапия опухолей – воздействие на единичные опухолевые стволовые клетки.

Слайд 20

а - Эмбриоидные тела
б - Начало миграции клеток
из эмбриоидного тела

и их дифференцировки

Начальные этапы дифференцировки ЭСК в культуре

Слайд 21

Дифференцировка ЭСК человека под действие различных факторов роста

Слайд 22

Дорзоморфин
89% клеток дифференциируют по нейрональному пути
hESC

Слайд 23

Ниша стволовых клеток

Слайд 24

Ниша стволовых клеток в волосяном фолликуле
1 - стволовые клетки наружного волосяного

влагалища ниже сальной железы; 2 - базальная мембрана; 3 - эпидермис; 4 - волосяная луковица; 5 - сальная железа

Слайд 25

цитоплазма
ядро
транскрипция
Молекулярный механизм поддержания «стволовости» ЭСК в семенниках дрозофилы

Слайд 26

Ключевые факторы транскрипции, поддерживающие «стволовость» ЭСК
Oct-4 – Присутствует в ЭСК, эктодерме

гаструлы, примордиальных (первичных) зародышевых клетках. Определенный уровень белка (0,5 – трофэктодерма, 1,5 – примитивная эндодерма). Регуляция транскрипции – сам по себе и в комплексе с другими ТФ (Oct4-Sox2)
Nanog - Обеспечивает самообновление ЭСК. Экспрессия в др. плюрипотентных клетках

Слайд 27

Основные назначения «ниши» для стволовых клеток
ограничение пролиферации стволовых клеток только

необходимостью поддержи-вать тканевой гомеостаз;
2) создание условий для максимальной защищенности стволовых клеток от внешних воздействий.

Слайд 28

Региональные стволовые клетки
Региональные стволовые клетки

Слайд 29

Мезенхимальные стволовые клетки
Ведут свое происхождение от зародышевого листка мезенхимы.

Содержатся в костном мозге, надкостнице, жировой ткани, синовиальной оболочке, скелетной мускулатуре и молочных зубах. Эти клетки обладают способностью дифференцироваться в клетки соединительной ткани, включая кость, жир, хрящ и мускулатуру.

Описано их использование для лечения коронарной болезни артерий, повреждение спинного мозга, болезнь Паркинсона и регенерация печени, для восстановления костей и хряща и при лечении остеоартрита.

Слайд 30

Гемопоэтические стволовые клетки — плюрипотентные кроветворные стволовые клетки, которые способны

многократно делиться и дифференцироваться во все классы эритроидных клеток крови (лейкоциты, эритроциты, тромбоциты и др.). Первые ГСК обнаруживаются в областях мезодермы, называемых аорта, гонада и мезонефрос. В период внутриутробного развития ГСК присутствуют в желточном мешке, печени, селезенке и костном мозге. Трансплантированные в организм Г.с.к. способны восстанавливать систему кроветворения при ее поражении при болезни или химиотерапии. Источником ГСК, пригодных для трансплантации, служат клетки костного мозга, пуповинная кровь.

Слайд 31

Нейрональные стволовые клетки
- Мультипотентные клетки, которые способны многократно делиться и дифференцироваться

во все классы нейрональных клеток мозга (нейроны, олигодендроциты и астроциты).
- Располагаются в субвентрикулярной зоне латеральных желудочков мозга и в субгранулярной зоне гиппокампа.

Слайд 32

Маркеры региональных стволовых клеток
Стволовые клетки
Белок-маркер
Стволовые нейрональные клетки
Нестин, Sur8
Начало

специализации нейрональных клеток-предшественников

Виментин

Клетки, развивающиеся в нейрональном направлении

бета3-тубулин, энолаза

Клетки специализирующие как вспомогательные, глиальные

Глиальный фибриллярный кислый белок, белок S-100

Сперматогонии на стадии XII Nanog, Oct-4 Амплифицирующиеся сперматогонии Plzf, Gfra1 Пролиферирующие сперматогонии Stra8

Слайд 33

Использование стволовых клеток в исследовательских целях и в медицине
Направленная дифференцировка

Слайд 34

Перечень заболеваний, при лечении которых в отдельных случаях была успешно применена

трансплантация стволовых клеток
Основное внимание уделяется лечению злокачественный новообразований (в первую очередь, лейкозов).
Появляются сообщения об успешной трансплантации стволовых клеток при заболеваниях сердечно-сосудистой и нервной систем (инсульта, болезней Паркинсона и Альцгеймера).
Проводятся исследования по применению стволовых клеток при лечении инфаркта миокарда и сердечной недостаточности. Разработаны международные протоколы лечения рассеянного склероза.

Слайд 35

В глазу человека обнаружены особые стволовые клетки, которые не только способны

превращаться в высокочувствительные к свету клетки, но и нивелировать процессы, приводящие к дегенеративной слепоте.
Выращены искусственные пенисы из стволовых клеток подопытных кроликов.
Показано, как стволовые клетки в теле мышей и крыс могут быть мобилизованы, чтобы сформировать новую мышцу в поврежденных участках тела.

Последние новости

Слайд 36

Индукция плюрипотентности в фибробластах с помощью ретровирусных конструкций, содержащих гены:
4

фактора: Oct3/4, Sox2, c-Myc, Klf4 (Takahashi et. аl., 2006) Фибробласты мыши
4 фактора: Oct3/4, Sox2, c-Myc, Klf4 (Takahashi et. аl., 2007) Фибробласты человека
4 фактора: Oct4, Sox2, NANOG, LIN28 (Junying Yu et. аl., 2007) Фибробласты человека
- 3 фактора: Oct3/4, Sox2, Klf4 (Nakagava et. аl., 2008) Фибробласты человека

Индуцированные плюрипотентные клетки (iPS cells)

Слайд 37

Ретровирусы
Аденовирусы
Вальпроевая к-та
Варианты получения iPS клеток
0,01%
0,1%
0,001%
Ретровирусы
Использование рекомбинантных белков

Слайд 38

Ген c-myc – ключевой для получения полноценных iPS
Тест с химерными

мышами показал, что 3F-iPSC (отсутствие гена c-myc в коктейле Яманаки)
приводит к непередаче химерных свойств по наследству.
Главное в этом: контроль ацетилирования гистонов (эпигенетика)

Слайд 39

Дальнейшее развитие метода
1) Использование белков (2011).
2) Химически индуцированные

плюрипотентные стволовые клетки, ХИПСК (смесь из 7 маленьких молекул - индукторов путей сигнальной трансдукции и модуляторов эпигенетики: forskolin, methylhydroxyptamine, D4476, azacytidine и др.) (2013).

Дальнейшее развитие метода
1) Использование белков (2011).
2) Химически индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, ХИПСК (смесь из 7 маленьких молекул - индукторов путей сигнальной трансдукции и модуляторов эпигенетики: forskolin, methylhydroxyptamine, D4476, azacytidine и др.) (2013).

Слайд 40

Cочетание трех небольших соединений (форсколина, основного фактора роста фибробластов и

ингибитора фермента киназы гликогенсинтазы-3 GSK-3beta ) позволило перепрограммировать ИПСК в мышечные клетки, успешно прижившиеся у мышей.
2) Удаление белка MBD3 из взрослых клеток может в несколько раз повысить эффективность и скорость их перепрограммирования.
3) Репрограммирование in vivo (коктейль Яманаки у трансгенных мышей под контролем доксорубицина).

Новые данные о перепрограммировании клеток

Слайд 41

Белок Oct-4 – играет ключевую роль в самообновлении недифференцированных эмбриональных стволовых

клеток.
Клетки кожи с введенным геном выращивали в среде с цитокинами, стимулирующими кроветворение – гематопоэтические стволовые клетки.

Получение кроветворных клеток из кожи – обходной механизм

Слайд 42

Спектр белков, с которым взаимодействуют коровые транскрипционные факторы в ЭСК

Слайд 43

Три основных способа получения плюрипотентных стволовых клеток из соматических клеток

Слайд 44

Трансгеноз, трансгенез (transgenesis) [лат. trans(ferre) — переносить и греч. genes(is) —

происхождение] — искусственный перенос экзогенной ДНК, приводящий к ее интеграции с геномом клеток раннего эмбриона, в результате чего эта ДНК (ген) содержится во всех клетках развивающе-гося из эмбриона взрослого организма и передается по наследству как менделирующий признак.

Трансген – ген, перенесенный в целый организм с помощью трансгеноза.

Трансгенный организм – организм, содержащий в геноме всех своих клеток чужеродную ДНК (трансген), передающуюся по наследству.

Слайд 45

Инъекция ДНК в один из пронуклеусов зиготы

Имплантация инъецированной зиготы в приемную

мать

Псевдобеременная самка

Тестирование наличия трансгена

Инъекция ДНК в один из
пронуклеусов зиготы

Имплантация инъецированной зиготы в приемную мать

Псевдобеременная самка

Потомство (около 10% содержит трансген)

Тестирование наличия трансгена

Классическая схема трансгеноза

Получение оплодотворенных яиц

Скрещивание и получение потомства

Слайд 46

Зигота человека
Зигота свиньи

Слайд 47

Слайд 48

Из истории микроинъекций
Т. Лин, середина 60-х годов – первые микроинъекции веществ

в яйцеклетку мыши
Гермерад, 1976 – инъекции ДНК в яйца дрозофилы
Гордон, 1977 – показал функционирование мРНК и ДНК в ооцитах ксенопуса
Гордон, 1980 – инъекции ДНК в пронуклеус зиготы мыши, первая трансгенная мыш

Слайд 49

1. Приемы переноса генов с помощью вирусов SV-40 и MoMLV (Р.

Яниш, Б. Минц с 1974 г.)
- инъекцией вируса под оболочку предимплантацион-
ных эмбрионов,
- прямая инфекция освобожденных от оболочек
предимплантационных эмбрионов,
- кокультивирование предимплантационных эмбрионов
с монослоем мышиных клеток, продуцирующих вирус,
3. - инъекция вируса в полость бластоцисты,
- инъекция клеток-продуцентов вируса в полость
Б бластоцисты,
5. - инъекция вирусов в ткани зародышей постимпланта-
ционных стадий развития,
6. - вирусная инфекция ES клеток и инъекция их
в полость бластоцисты,
- инфекция вирусным вектором яйцеклеток и зигот
млекопитающих (1998 – 2002, КРС, обезьяна, мыши).

Слайд 50

Перенос вирусов в с/х животных
Salter, 1987 – куры (вирус лейкемии

птиц)
Narvey, 1990 – овцы (кошачий вирус лейкемии)
Narvey, 1990 – свиньи (кошачий вирус лейкемии)
Kim et al., 1993 – коровы (вирус Молони с оболочкой вируса лейкемии гиббона)

Слайд 51

Схема переноса генов с использованием ретровирусных векторов
Культуральная среда

Слайд 52

Получение трансгенных мышей с использованием ретровирусного вектора
8-клеточный эмбрион
Самка-донор
Рекомбинантный ретровирус
Трансген
Инфицирование и имплантация

эмбриона в приемную мать

Самка с имплантантом

Трансгенная мышь

Тестирвание наличия трансгена

Слайд 53

Трансфекция сперматозоидов: липофекция, использование диметилсульфоксида и др
Трансгеноз с помощью сперматозоидов

Слайд 54

Bracket et al., 1971 – захват спермиями чужеродной ДНК
Lavitrano et

al., 1989 – трансгенная мышь
Brinster, 1989 – не воспроизвел этот результат
Bachiller et al., 1991 - ДНК-липосомные комплексы
Chang et al., 1999 – кролики, крысы
Кузнецов, 1999 – с/х. животные

Перенос генов с помощью сперматозоидов

Слайд 55

Способы трансгеноза
Микроинъекция в пронуклеусы зигот или ядра эмбрионов, электро-порация, баллистическая трансфекция

Фрагменты ДНК

Техника переноса

Носители ДНК

Генетические конструкции

Вирусы и вирусные векторы

Инфицирование эмбрионов или плодов

Оплодотворение яйцеклеток

Сперматозоиды, обработанные ДНК

Получение химер

Перенос ядер в энуклеированный ооцит (клонирование)

Трансфицированные ЭСК

Ядра трансфицированных ЭСК

Гаплоидные ЭСК

Внутрицитоплазма-тическеий перенос в ооцит

Слайд 56

Эмпирически подобранные условия для наиболее эффективного получения трансгенных организмов (мышей) с

помощью микроинъекций

Для инъекций удобен мужской пронуклеус (эффективность слегка выше)
Наибольшая эффективность при введении ДНК в фазу синтеза ДНК в зиготе
Объем вводимого раствора около 1 пкл
Оптимальная концентрация ДНК – 1-3 нг/мкл
Гибридные линии животных более удобны для трансгеноза
Вводимая ДНК (трансген) может быть как в линейной, так и в кольцевой форме.
Размер трансгена не влияет существенно на эффективность трансгеноза

Слайд 57

На сегодняшний день:
1 трансгенная мышь из 10-40 инъецированных зигот
1 трансгенная

корова из 1600 инъецированных зигот.
Цена трансгенного животного:
1 мышь – 100$, 1 овца – 60000 $, одна корова – 550000 $.

Эффективность и стоимость трансгеноза у животных

Слайд 58

Трансмитохондриальный организм (trans-mitochondrial organism) — животный организм, содержащий в своих клетках

митохондрии другого организма, который получают путем инъекции чужеродных митохондрий в цитоплазму зиготы или эмбриональных стволовых клеток, или с использованием транс-митохондриальных цибридов. Лабораторный Т.о. представляет собой адекватную модель митохондриальных болезней человека, передаваемых по материнской линии. Первый Т.о. (мышь), передающий митохондрии по наследству, был получен Д. Валласом с соавт. в 1999 г.

Слайд 59

Слайд 60

«Ребенок от трёх родителей»
- Митохондриальные болезни встречаются у 1 из 6500

детей.
- Описано около 50 генетических заболеваний, связанных с мутациями в ДНК митохондрий, многие из которых являются смертельными в раннем детстве.
- В ходе процедуры получения «ребенка от трёх родителей» поврежденные митохондрии матери заменяются здоровыми митохондриями яйцеклетки другой женщины-донора. Так как эти изменения передаются из поколения в поколение, это позволит избавиться от болезни будущим поколениям в семье.

Слайд 61

Слайд 62

Цисгеноз (сisgenesis) — процесс получения генетически-модифицированных организмов, основанный на методах генной

инженерии, при котором в отличие от обычного трансгеноза перенос генов вместе с их собственными регуляторными элементами осуществляется только между тесно связанными скрещивающимися в природе организмами (напр., перенос генов картофеля в геном картофеля), что приводит к усилению или ослаблению уже существующего у организма признака. Термин «Ц.» впервые использовал Я. Шаарт (J. Schaart) в 2004 г. Син.: интрагенез (intragenesis)

Слайд 63

Паратрансгеноз (paratransgenesis)
[лат. para — возле, при, вне, trans(ferre) — переносить и

греч. genesis — происхождение] — метод переноса экзогенного генетического материала в целые организмы с помощью бактерий-симбионтов или вирусов-симбионтов. П. направлен обычно на подавление патогена в переносчиках инфекций, приводящих к различным заболеваниям. Напр., с помощью генетически модифицированной бактерии Sodalis были получены мухи це-це, устойчивые к инфекции трипаносомами, которые являются возбудителями малярии. Метод предложен Ч. Бирдом с соавт. в 1993 г.

Слайд 64

-- Изучение функции генов
- Изучение механизмов регуляции экспрессии генов

(ткане – и стадиеспецифическая экспрессия)
- Изучение механизмов индивидуального развития
- Изучение механизмов мутагенеза
- Поиск генов, ответственных за различные патологии человека
- Моделирование заболеваний человека
- Испытание лекарственных препаратов
- Создание животных-биореакторов
(продуценты фармакологических препаратов)
- Создание организмов с новыми продуктивными свойствами
(повышение темпов роста, увеличение плодовитости,
устойчивость к вирусным инфекциям и др.).

Проблемы, решаемые с помощью трансгеноза

Молекулярная генетика онтогенеза

Содержание

Стволовые клетки

Стволовые клетки (история)1908: российским ученым Александром Максимовым предсказано существование СК (им

Тератокарциномы – ключ к обнаружению стволовых клетокТератокарциномы – злокачественные тератомы, которые

Свойства тератокарциномных клеток- Неоднородный состав клеток- Аномалии кариотипа- Легко культивируются и

Получение химер из клеток тератокарциномы ХимераБластоциста

Получение эмбриональных стволовых клетокКлассический метод (М. Эванс и М. Кауфман,

Вид бластоцисты под электронным микроскопом

Тотипотентность (totipotency) [лат. totus — весь, целый и potentia — сила]

Основные свойства ЭСК 1) Плюрипотентность (тотипотентность?)2) Нормальный кариотип 3) Самоподдержание

Изоферменты щелочной фосфатазы, транскрипционные факторы Oct-4, Nanog, теломеразная активность, маркеры клеточной

Гаплоидные эмбриональные стволовые клетки — ЭС клетки с гаплоидным набором хромосом.

Гаплоидные половые клеткииз ЭСК В 2003 г. из эмбриональных стволовых клеток получены

Андрогенные гаплоидные ЭСК (AhаESC) Получение – перенос сперматозоида в энуклеированный ооцит, развитие

Strategies to generate offspring with PhaESCs and AhaESC.ооцитооцитзигота

Эмбриональные стволовые клетки – подобие раковых клетокНедифференцированные клетки;Способность к долговременному делению;Высокая

Искусственная дифференцировка клеток ВКМ бластоцисты в трофобластыТрофобластные СКES клеткиДифференциирующиеся трофобластные клетки

Опухолевые стволовые клетки — немногочисленные специфические долгоживущие и медленно пролиферирующие опухолевые

а - Эмбриоидные телаб - Начало миграции клеток из эмбриоидного тела

Дифференцировка ЭСК человека под действие различных факторов роста

Дорзоморфин89% клеток дифференциируют по нейрональному путиhESC

Ниша стволовых клеток

Ниша стволовых клеток в волосяном фолликуле1 - стволовые клетки наружного волосяного

цитоплазмаядротранскрипцияМолекулярный механизм поддержания «стволовости» ЭСК в семенниках дрозофилы

Ключевые факторы транскрипции, поддерживающие «стволовость» ЭСКOct-4 – Присутствует в ЭСК, эктодерме

Основные назначения «ниши» для стволовых клеток ограничение пролиферации стволовых клеток только

Региональные стволовые клеткиРегиональные стволовые клетки

Мезенхимальные стволовые клетки Ведут свое происхождение от зародышевого листка мезенхимы.