Моторные белки

ОТКРЫТИЕ КИНЕЗИНА – НАЧАЛО НОВОЙ ЭРЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Marine Biological Laboratory
Woods Hole, USA

1

Кинезины (Kinesins) и динеины (Dyneins) перемещаются по микротрубочкам

кинезины

кинезин-14

динеины

ТРИ КЛАССА МЕХАНОХИМИЧЕСКИХ АТФаз

Миозины

МИОЗИН II ИЗ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ

шея

Coiled coil - хвост

Легкие цепи

Моторные головки

Область

СЕМЕЙСТВО МИОЗИНОВ – 17 классов

Моторный домен

тип
миозина

структура

1000 аминокислотных остатков

МИОЗИН V

моторные домены

6 легких цепей

связывание
карго

МОЛЕКУЛА КИНЕЗИНА-1 - ГЕТЕРОТЕТРАМЕР

легкие цепи
~60 кДа

coiled coil стержень с изгибом

хвостовой

КИНЕЗИНЫ: ДОМЕННАЯ СТРУКТУРА

кинезин-1

Моторный домен:
360 аминокислотных остатков
АТФазный центр
участок

МОТОРНЫЕ ДОМЕНЫ КИНЕЗИНА И МИОЗИНА

Нуклеотид-связывающий
карман

Моторный домен кинезина

Участок

МЕХАНОХИМИЧЕСКИЙ ЦИКЛ
МЫШЕЧНОГО МИОЗИНА

Связывание АТФ – диссоциация от актина
Гидролиз АТФ

Ron Vale’s lab

МЕХАНОХИМИЧЕСКИЙ ЦИКЛ
КИНЕЗИНА-1

Связывание АТФ – изменение взаимного
расположения моторного

(Ron Vale’s lab)

ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИЙ ДИНЕИН: АТФаза ААА+

легкие цепи ~10-14 kDa

тяжелые цепи ~ 530 kDa

легкие

СЕМЕЙСТВО ДИНЕИНОВ

7 классов на основе выравнивания последовательностей тяжелых цепей

axonemal dyneins

Класс III

Класс IV

Класс V

Класс VI

Класс VII

Outer arms dynein

Inner

микротрубочка

моторный домен динеина

моторный домен кинезина-1

(Carter et al., 2011; Spudich, 2011)

РАЗМЕР

(Graham Johnson, Ron Vale’s lab)

СПОСОБЫ ИЗУЧЕНИЯ МОТОРНЫХ БЕЛКОВ

Электронная микроскопия отдельных молекул с напылением

КАК РАБОТАЮТ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МОТОРЫ?

Происходит ли изменение конформации при гидролизе АТФ?
Как определяется

МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ДОКИНГ МИОЗИНА НА ФИЛАМЕНТЕ АКТИНА

Вращение участка S1, содержащего легкие

МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ДОКИНГ КИНЕЗИНА НА МИКРОТРУБОЧКЕ

А – прикрепленная головка
F – свободная головка

(Arnal

АТОМНО-СИЛОВАЯ МИКРОСКОПИЯ
ATOMIC FORCE MICROSCOPY, AFM

принцип

устройство

лазер

образец

рычаг

пьезо-электрический
транслятор

детектор

поверхность

острие

ПО СРАВНЕНИЮ С ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИЕЙ AFM:

имеет близкое и даже

Кинезин-1 на микротрубочке
in vitro в присутствии AMPPNP

Миозин V шагает по

ПРОВЕРКА «ШЕИ» НА ПРОЧНОСТЬ

Coiled-coil
фрагмент
шейного участка
кинезина-1

кантилевер
AFM

фрагменты
филамина

Cys

Зависимость расплетания

Kin 14

Kin 1

полярность

1 13 327 338 975

1 хвост Coiled-coil stalk 329

IN VITRO MOTILITY ASSAY

Моторный белок сорбируется на стекло

Пластиковые микросферы
-

ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИЕ ФИЛАМЕНТЫ АКТИНА
СКОЛЬЗЯТ ПО СТЕКЛУ, ПОКРЫТОМУ МИОЗИНОМ

дифференциальный
интерференционный
контраст

(Andrew Carter’s lab)

ПРОЦЕССИВНОСТЬ МОТОРНЫХ БЕЛКОВ

Плотность кинезина (мкм-2)

Плотность НММ (мкм -2)

Скорость (мкм/сек)

Скорость (мкм/сек)

Длина микротрубочки

SINGLE MOLECULE FLUORESCENCE

Синтетические флуорохромы
Флуоресцирующие белки
Quantum Dots

микротрубочка

объектив
микроскопа

кинезин

возбужденный
флуорофор

(Ron Vale’s homepage)

Quantum Dots, покрытые динеином,
скользят по микротрубочкам

Зеленый динеин

СКОРОСТИ, РАЗВИВАЕМЫЕ РАЗНЫМИ МОТОРНЫМИ БЕЛКАМИ

производство и регистрация сил - в диапазоне pN
временное разрешение – миллисекунды
пространственное

КИНЕЗИН-1 НЕСЕТ МИКРОСФЕРУ ПО МИКРОТРУБОЧКЕ

Свободное движение

Движение в оптической ловушке

(S. Block’s

ВЛИЯНИЕ ПРИЛОЖЕННОЙ СИЛЫ НА ДВИЖЕНИЕ КИНЕЗИНА

сила (pN)

сила (pN)

положение (нм)

положение (нм)

30

КИНЕЗИН В ОПТИЧЕСКОЙ ЛОВУШКЕ

время (сек)

положение (нм)

шаг кинезина-1 вдоль
микротрубочки =

(Hua et al., 2002)

Hand-over-hand

Inchworm

(Из обзора Yildiz et al., 2005)

МИКРОТРУБОЧКИ, СОБРАННЫЕ ИЗ ЧИСТОГО ТУБУЛИНА IN VITRO,
МОГУТ СОДЕРЖАТЬ

КИНЕЗИН ДВИЖЕТСЯ ПО ПРОТОФИЛАМЕНТУ

Опыт: скольжение микротрубочек по стеклу, покрытому кинезином-1

Время