Непрерывное культивирование микроорганизмов

Содержание

Слайд 2

непрерывное культивирование более перспективно Сущность: - в ферментаторе поддерживаются постоянные условия

непрерывное культивирование более перспективно
Сущность:
- в ферментаторе поддерживаются постоянные условия

среды,
- микроорганизмы остаются в определенном физиологическом состоянии;
- подается свежая питательная среда и удаляется избыток среды с продуктами метаболизма,
- поддерживается фаза экспоненциального роста.
Слайд 3

Если для культивирования продуцента используется один ферментатор - гомогенно-непрерывный процесс. Если

Если для культивирования продуцента используется один ферментатор - гомогенно-непрерывный процесс.
Если

используется батарея ферментаторов - это гетеро-непрерывный процесс, так как в каждом ферментаторе, соединенном в батарею, поддерживаются постоянные условия.
Слайд 4

При непрерывном культивировании микроорганизмов отсутствует смена фаз развития культуры. Скорость потока

При непрерывном культивировании микроорганизмов отсутствует смена фаз развития культуры.
Скорость потока питательной среды

и отвода культуральной жидкости из системы необходимо отрегулировать, чтобы концентрация клеток оставалась постоянной.
В стерильных условиях непрерывный метод обеспечивает сохранение культуры в физиологически активном состоянии длительное время.
Слайд 5

Две разновидности непрерывных процессов - тубулярные; питательная среда и посевной материал

Две разновидности непрерывных процессов

- тубулярные;
питательная среда и посевной материал непрерывно поступают

в аппарат, в котором нет обратного смешения.
- хемостатные;
питательная среда и посевной материал поступают в аппарат, в котором происходит постоянное перемешивание.
Слайд 6

Тубулярный процесс Жидкость на входе в аппарат смешивается с посевным материалом.

Тубулярный процесс

Жидкость на входе в аппарат смешивается с посевным материалом.
По мере

их продвижения в аппарате одновременно осуществляются рост биомассы и процесс ферментации.
Движение может быть горизонтальным или вертикальным (аппарат башенного типа: движение жидкости снизу вверх) для анаэробных процессов.
Слайд 7

Тубулярный процесс Схема тубулярного непрерывного процесса ферментации

Тубулярный процесс

Схема тубулярного непрерывного
процесса ферментации

Слайд 8

Тубулярный процесс Время движения жидкости t1 от входа в аппарат до

Тубулярный процесс

Время движения жидкости t1 от входа в аппарат до любого

сечения по длине потока l можно рассчитать как
t1 = l · A/ F,
где А – площадь сечения потока; F – объемный расход жидкости.
На выходе из аппарата (при l = L) время пребывания жидкости составляет:
tL = L · A/ F
Слайд 9

Тубулярный процесс Тубулярный процесс с учетом закономерностей протекания процесса ферментации полностью

Тубулярный процесс

Тубулярный процесс с учетом закономерностей протекания процесса ферментации полностью подобен

периодическому.
Сложность: в непрерывной подаче посевного материала решается путем организации рециркуляции части потока с выхода аппарата на вход.
Слайд 10

Тубулярный процесс Схема тубулярного непрерывного процесса с рециркуляцией посевного материала

Тубулярный процесс

Схема тубулярного непрерывного
процесса с рециркуляцией посевного
материала

Слайд 11

Тубулярный процесс Преимуществом тубулярного процесса является возможность более полного исчерпания субстрата

Тубулярный процесс

Преимуществом тубулярного процесса является возможность более полного исчерпания субстрата (как

и в периодическом процессе).
Недостатком – невозможность организовать аэрацию во всех зонах по длине аппарата; большая склонность к инфицированию.
Слайд 12

Хемостатный процесс непрерывного культивирования Ферментация протекает в аппарате с мешалкой; В

Хемостатный процесс непрерывного культивирования

Ферментация протекает в аппарате с мешалкой;
В аппарат с

постоянной скоростью подается свежая питательная среда;
Из аппарата с такой же скоростью отводится ферментационная среда, содержащая биомассу, продукт метаболизма и остатки субстрата.
Предполагают, что в любой точке аппарата и на выходе из него концентрации S, X, P равны.
Слайд 13

схема хемостатного непрерывного процесса ферментации

схема хемостатного непрерывного процесса ферментации

Слайд 14

Посевной материал на вход в аппарат не подают непрерывно. Засев производится

Посевной материал на вход в аппарат не подают непрерывно.
Засев

производится единовременно при запуске культуры от периодического процесса, биомасса непрерывно сохраняется в ферментере и специального подсева не нужно.
Закономерности хемостатного процесса описаны с помощью математической модели кинетики процесса
Слайд 15

Допущения для математической модели: μ = μm(S/KS + S); (по Моно)‏

Допущения для математической модели:

μ = μm(S/KS + S); (по Моно)‏
μ =

0 (отсутствует диссимиляция биомассы),
QP = 0 (нет образования продуктов метаболизма),
ǬP = 0 (нет инактивации продукта метаболизма)‏,
mS = 0 (нет затрат на поддержание жизнедеятельности культуры).
Слайд 16

Выражение для материального баланса в ферментере V dX/dt = μmS/(KS+S)· XV

Выражение для материального баланса в ферментере

V dX/dt = μmS/(KS+S)· XV

– FX;
V dS/dt = FS0 – 1/YXS ·μmS/(KS+S)·XV – FS
Приток Расход на рост биомассы Отток
Здесь V-объем ферментационной жидкости в аппарате, сохраняемый на постоянном уровне.
Принимаем: D = F/V, где D – скорость разбавления, ч-1
Слайд 17

систему уравнений: V dS/dt = FS0 – 1/YXS · μmS/(KS+S) ·

систему уравнений:
V dS/dt = FS0 – 1/YXS · μmS/(KS+S) ·

XV – FS;
V dX/dt = μmS/(KS+S) · XV – FX;
можно записать упрощенно:
dS/dt = D (S0-S) – 1/YXS μX;
dX/dt = μX – DX;
Введем в уравнение dX/dt = μX – DX; вместо μ зависимость μ(S):
dX/dt = μmS/(KS+S) - DX
dS/dt = D (S0-S) – 1/YXS μX;
Слайд 18

В непрерывном хемостатном процессе довольно быстро устанавливается стационарное состояние, при котором

В непрерывном хемостатном процессе довольно быстро устанавливается стационарное состояние,
при котором


- скорость роста биомассы будет равна скорости ее вымывания из аппарата,
- скорость притока субстрата за вычетом оттока остаточного субстрата равна скорости его расходования на рост микроорганизмов.
при этом dX/dt = 0, dS/dt = 0
Слайд 19

Решая при этих условиях уравнение баланса биомассы, получаем: μ X –

Решая при этих условиях уравнение баланса биомассы, получаем:
μ X – DX

= 0 и μ = D,
в установившемся состоянии удельная скорость роста равна скорости разбавления D (параметр, задаваемый оператором).
Если в установившемся состоянии в момент времени t0 по каким-либо причинам μ ≠ D, возникает переходный процесс по биомассе.
Слайд 20

2 X переходные процессы, возникающие в непрерывном хемостатном процессе при изменении

2

X

переходные процессы, возникающие в непрерывном хемостатном процессе при изменении скорости разбавления

или удельной скорости роста биомассы

μ > D

Слайд 21

Из уравнения dX/dt = μX – DX следует, что если μ>D,

Из уравнения dX/dt = μX – DX следует, что если μ>D,

то скорость роста биомассы в аппарате dX/dt > 0 и биомасса возрастает.
При этом она потребляет из среды больше субстрата, концентрация его снижается, уменьшается и μ.
Устанавливается новое равновесное состояние μ=D при большей концентрации биомассы.

в хемостате осуществляется саморегулирование

Слайд 22

в хемостате осуществляется саморегулирование Если величина μ При этом новое установившееся

в хемостате осуществляется саморегулирование

Если величина μ < D, то dX/dt <

0, и концентрация биомассы начнет снижаться, соответственно будет возрастать концентрация субстрата.
При этом новое установившееся состояние будет при более низкой концентрации биомассы.
Слайд 23

Определение концентрации субстрата и биомассы в установившемся процессе в хемостате С

Определение концентрации субстрата и биомассы в установившемся процессе в хемостате

С учетом

μ X – DX = 0 и μ = D, можно записать: μmS/(KS+S) = D,
откуда S = KSD/ (μm – D),
D(S0-S) – 1/YXS · μX = 0,
поскольку μ = D, получаем
X = YXS (S0 – S) или
X = YXS [S0 – KSD/ (μm – D)]
Слайд 24

Графические зависимости между установившимися значениями X и S в хемостатном процессе

Графические зависимости между установившимися значениями X и S в хемостатном процессе

и скоростью разбавления D называют хемостатными кривыми.

Хемостатные
кривые X(D) и S(D)
в стационарном
состоянии

Слайд 25

Хемостатная кривая X(D) имеет особеннность: концентрация биомассы снижается до нуля при

Хемостатная кривая X(D) имеет особеннность: концентрация биомассы снижается до нуля при

повышении скорости разбавления до некоторого критического значения.
физически это означает, что культура вымывается. выходит больше биомассы, чем может вырасти.
При каких значениях Dкр происходит вымывание?
X = YXS [S0 – KSD/ (μm – D)] = 0;
S0 = KSDкр/ (μm – Dкр); Dкр = μmS0/(KS+S0)‏
Слайд 26

Отсюда следует, что вид хемостатной кривой зависит от S0. При D

Отсюда следует, что вид хемостатной кривой зависит от S0.
При D

= 0, X = YXSS0
Начальное положение хемостатной кривой и точка вымывания зависят от концентрации субстрата в свежей среде (подпитке) S0.
Эта величина наряду со скоростью разбавления является параметром, с помощью которого можно управлять процессом.
Слайд 27

Интересную особенность имеет зависимость стационарной (остаточной) концентрации субстрата от начальной (входной)

Интересную особенность имеет зависимость стационарной (остаточной) концентрации субстрата от начальной (входной)

концентрации.
В уравнении S = KSD/ (μm – D) нет, ничего кроме D и кинетических констант KS, μm.
Слайд 28

парадоксальный вывод: при любом изменении концентрации субстрата во входящем потоке S0

парадоксальный вывод: при любом изменении концентрации субстрата во входящем потоке S0

в стационарном состоянии при заданной скорости разбавления устанавливается одна и та же остаточная концентрация субстрата S.
Именно это свойство хемостата дало ему название: концентрация субстрата (химического соединения) стабилизируется сама по себе независимо от колебаний на входе.
Слайд 29

Что регулируется оператором? - скорость разбавления; (поэтому процесс иногда называют «спидостат»).

Что регулируется оператором?

- скорость разбавления; (поэтому процесс иногда называют «спидостат»).
Возникает вопрос:

к чему стремиться?
производительность процесса QX (коли-чество биомассы, образующейся в единицу времени единицей объема среды в аппарате) для непрерывного процесса:
QX = DX, после подстановки выражения
X = YXS [S0 – KSD/ (μm – D)]
QX = DYXS [S0 – KSD/ (μm – D)]
Слайд 30

Практический интерес представляет определение условий (скорости разбавления) при которых величина будет оптимальной.

Практический интерес представляет определение условий (скорости разбавления) при которых величина будет

оптимальной.
Слайд 31

производительность по биомассе в хемостатном процессе сначала возрастает до Donт, а

производительность по биомассе в хемостатном процессе сначала возрастает до Donт, а

затем резко падает

Зависимость
производитель-
ности по биомас-
се QX, концентра-
ции биомассы Х
и остаточной
концентрации
субстрата S от
скорости разба-
вления D в хемо-
статном процессе

Слайд 32

СРАВНЕНИЕ ПРОИЗВОДИТЕЛЬНОСТИ ПЕРИОДИЧЕСКОГО И НЕПРЕРЫВНОГО ПРОЦЕССОВ Предположим, что после загрузки и

СРАВНЕНИЕ ПРОИЗВОДИТЕЛЬНОСТИ ПЕРИОДИЧЕСКОГО И НЕПРЕРЫВНОГО ПРОЦЕССОВ

Предположим, что после загрузки

и до самого конца процесса биомасса растет с максимальной скоростью μ = μm. Однако рост начинается после подготовки аппарата, загрузки среды и посевного материала и лаг-фазы - с момента времени tо.
Слайд 33

Рост биомассы описывается уравнением:

Рост биомассы описывается уравнением:

Слайд 34

Предположим, что рост идет до некой максимальной для данного аппарата концентрации

Предположим, что рост идет до некой максимальной для данного аппарата

концентрации биомассы Хт (концентрация биомассы не может возрастать до бесконечности, так как при этом возникают ограничения по массообменным возможностям аппарата; каждый аппарат имеет свой предел).
Достижение этой концентрации происходит в момент времени tK (для периодического процесса)‏
Слайд 35

картина роста биомассы при принятых допущениях

картина роста биомассы при принятых допущениях

Слайд 36

Подставляя Х= Хт и t = tК в уравнение получаем:

Подставляя Х= Хт и t = tК в уравнение

получаем:

Слайд 37

Для непрерывного процесса в том же аппарате производительность по биомассе определяется

Для непрерывного процесса в том же аппарате производительность по биомассе определяется

по другому.
Чтобы найти максимально возможную производительность непрерывного процесса в том же аппарате, в котором проводили и периодический процесс, надо проанализировать формулу для QХопт.
Из нее следует, что чем больше концентрация субстрата на входе в аппарат, тем больше - оптимальная концентрация биомассы.
Слайд 38

Но это возрастание также не может быть бесконечным, пределом выступают массообменные

Но это возрастание также не может быть бесконечным, пределом выступают

массообменные возможности аппарата. Работу можно проводить при концентрации биомассы не более Хт. Приближенно:
Слайд 39

подставляя Определим соотношение Qнепр/Qпериод: в уравнение: Dопт = μm [1 -

подставляя

Определим соотношение Qнепр/Qпериод:

в уравнение: Dопт = μm [1 - √KS/(S0 +

KS)],
получаем Dопт ≈ μm ,
из уравнения
Слайд 40

В начале процесса инокулят обычно составляет по объему около 5 %

В начале процесса инокулят обычно составляет по объему около 5

% от объема среды, а концентрация биомассы в нем примерно такая же, как в конце ферментации - Хт. Отсюда

после подстановки в соотношение получаем:

Слайд 41

примем t0 = 10 часов (это время подготовки к следующей ферментации).

примем t0 = 10 часов (это время подготовки к следующей ферментации).
Для

быстро растущих культур (бактерии, дрожжи)‏
μm = 0,5 ч-1;
Qнепр/Qпериод ≈ 8
Для медленно растущих культур (грибы, актиномицеты)‏
μm = 0,05 ч-1;
Qнепр/Qпериод ≈ 3,5
вывод: непрерывный процесс имеет более высокую продуктивность по биомассе, чем периодический.
Слайд 42

ОТКЛОНЕНИЯ ОТ ТЕОРИИ ХЕМОСТАТА ПРИ ЛИМИТИРОВАНИИ ПРОЦЕССА РАЗЛИЧНЫМИ СУБСТРАТАМИ Хемостатные кривые

ОТКЛОНЕНИЯ ОТ ТЕОРИИ ХЕМОСТАТА ПРИ ЛИМИТИРОВАНИИ ПРОЦЕССА РАЗЛИЧНЫМИ СУБСТРАТАМИ

Хемостатные кривые X(D)

чувствительны к изменению кинетических зависимостей при лимитировании процесса различными субстратами.
Углерод. Отклонение от классической хемостатной кривой (снижение концентра-ции биомассы при малых скоростях разбавления) связано с повышенным расходом субстрата на поддержание жизне-деятельности микроорганизмов при малых удельных скоростях роста биомассы.
Слайд 43

Если решить систему уравнений: dX/dt = μmS/(KS+S) - DX dS/dt =

Если решить систему уравнений:
dX/dt = μmS/(KS+S) - DX
dS/dt = D (S0-S)

– 1/YXS μX;
с учетом затрат на поддержание жизнедеятельности, получится хемостатная кривая
Слайд 44

вид хемостатной кривой при лимитировании азотом или серой

вид хемостатной кривой при лимитировании азотом или серой

Слайд 45

Азот или сера. Наблюдаемые отклонения отражают превышение концентрации биомассы при малых

Азот или сера. Наблюдаемые отклонения отражают превышение концентрации биомассы при малых

скоростях разбавления по сравнению с идеальным хемостатом. Клетки при малой скорости роста накапливают резервные соединения (полисахариды, полиоксибутират, липиды), и по массе их как бы становится больше.
Такой режим лимитирования в обиходе называют «жировым». Если выражать концентрацию биомассы не в г/л, а в числе клеток на литр, получается обычная форма графика.
Слайд 46

Магний, фосфор, калий. По виду хемостатная кривая похожа на кривую для

Магний, фосфор, калий. По виду хемостатная кривая похожа на кривую для

азота, но причина подобного отклонения здесь другая: клетки, растущие медленно, требуют меньше РНК, чем быстрорастущие.
Слайд 47

Сложная среда. На неопределенных по составу питательных средах происходит при различных

Сложная среда. На неопределенных по составу питательных средах происходит при различных

скоростях разбавления изменение лимитирования (переход с лимитирования одним субстратом на лимитирование другим). Хемостатная кривая не имеет участка плато, а все время снижается с повышением скорости разбавления. При этом изменяется и биохимический состав биомассы.
Слайд 48

Пристеночный рост биомассы. Хемостатная кривая в этом случае имеет аномально длинный

Пристеночный рост биомассы. Хемостатная кривая в этом случае имеет аномально длинный

«хвост», рост биомассы возможен даже при D > μm (так как растущая на стенках биомасса не вымывается).
Слайд 49

ХЕМОСТАТНЫЙ ПРОЦЕСС КУЛЬТИВИРОВАНИЯ, ЛИМИТИРОВАННЫЙ КИСЛОРОДОМ Кинетика роста аэробных культур микроорганизмов зависит

ХЕМОСТАТНЫЙ ПРОЦЕСС КУЛЬТИВИРОВАНИЯ, ЛИМИТИРОВАННЫЙ КИСЛОРОДОМ

Кинетика роста аэробных культур микроорганизмов

зависит от двух субстратов. Вторым является кислород. Общая зависимость представлена в виде альтернативного уравнения.
Слайд 50

Если ферментационное оборудование недостаточно интенсивное, эта зависимость вырождается в однофакторную зависимость

Если ферментационное оборудование недостаточно интенсивное, эта зависимость вырождается в однофакторную зависимость от

концентрации растворенного кислорода С:

Уравнение баланса биомассы в непрерывном процессе с лимитированием кислородом такое же, как при лимитировании обычным субстратом, только вместо концентрации не газообразного субстрата S в уравнении использована концентрация растворенного кислорода С:

Слайд 51

Из условия стационарности dX/dt = О можно найти значение установившейся концентрации растворенного кислорода:

Из условия стационарности dX/dt = О можно найти значение установившейся

концентрации растворенного кислорода:
Слайд 52

Последним членом уравнения в связи с низкой растворимостью кислорода в жидкости

Последним членом уравнения в связи с низкой растворимостью кислорода в

жидкости можно пренебречь. Для стационарного состояния (dC/dt = 0) можно записать:

уравнение материального баланса для субстрата дополняется поступлением кислорода за счет массопередачи в жидкую фазу:

Слайд 53

отсюда концентрация негазообразного субстрата S, хотя и не лимитирует процесс, также

отсюда

концентрация негазообразного субстрата S, хотя и не лимитирует процесс, также зависит

от D

или

производительность хемостата
определяется формулой:

Слайд 54

производительность существенно зависит от величин KLa и С*. Критическая скорость разбавления определяется по выражению:

производительность существенно зависит от величин KLa и С*.

Критическая скорость
разбавления
определяется

по
выражению:
Слайд 55

При некотором достаточно малом значении скорости разбавления концентрация негазообразного субстрата снижается

При некотором достаточно малом значении скорости разбавления концентрация негазообразного субстрата снижается

настолько, что начинает лимитировать рост биомассы.
При этом зависимость QX(D) приобретает вид, характерный для хемостата. Этот участок изображен пунктирной линией.

с возрастанием коэффи-циента разбавления продуктивность все время снижается, так как снижается скорость сорбции кислорода.

Слайд 56

в этом случае оптимальной скоростью разбавления является точка переключения лимитирования с

в этом случае оптимальной скоростью разбавления является точка переключения лимитирования

с растворенного в жидкости субстрата S на кислород.
Повышение величины KLa (т. е. массообменных возможностей аппарата) позволяет сдвинуть эту точку вправо и получить более высокую производительность процесса по биомассе.
Слайд 57

АВТОСЕЛЕКЦИЯ В НЕПРЕРЫВНОМ ПРОЦЕССЕ В ходе процесса культивирования под воздействием космических

АВТОСЕЛЕКЦИЯ В НЕПРЕРЫВНОМ ПРОЦЕССЕ

В ходе процесса культивирования под воздействием космических

лучей и различных мутагенных факторов в культуре происходят изменения, в результате которых может появиться штамм, имеющий более высокую удельную скорость роста, чем исходный.
С этого момента оба штамма начинают конкурировать за субстрат.
Слайд 58

изменение концентрации остаточного субстрата в непрерывном процессе при замещении штамма 1 штаммом 2

изменение концентрации остаточного субстрата в непрерывном процессе при замещении штамма 1

штаммом 2
Слайд 59

Если процесс протекает при скорости разбавления D1 то исходный штамм обеспечивает

Если процесс протекает при скорости разбавления D1 то исходный штамм

обеспечивает саморегулирование процесса при концентрации S1.
Если вначале процесс стабилизирован на уровне S1 то для штамма-мутанта μ2(S1) = D2 значительно больше D1.
Следовательно, концентрация биомассы этого штамма растет:
Слайд 60

Рост происходит до тех пор, пока концентрация субстрата не снизится до

Рост происходит до тех пор, пока концентрация субстрата не снизится до

S2. При этом исходный штамм станет вымываться из аппарата, поскольку μ1(S2) < = D1, и тогда

Если наблюдать за концентрацией биомассы в непрерывном процессе культивирования, то можно заметить скачкообразное повышение концентрации, свидетельствующее о самопроиз­ вольной селекции (автоселекции) новых
штаммов.

Слайд 61

внешнее проявление автоселекции в непрерывном процессе

внешнее проявление автоселекции в непрерывном процессе