Рекомбинантный инсулин

Июль 22, 2022

Главная
Биология
Рекомбинантный инсулин

Содержание

2. Инсулин - пептидный гормон, выделяемый β-клетками о. Лангенгарса. Состоит из двух пептидных цепей: А-цепь - из
4. История открытия инсулина связана с именем русского врача И.М. Соболева (вторая половина 19 века), доказавшего, что
5. В 1935 году датский исследователь Хагедорн оптимизировал действие инсулина в организме, предложив пролонгированный препарат. Первые кристаллы
6. Инсулин был открыт Фредериком Бантингом и Чарльзом Бестом, работавшими в лаборатории Дж. Маклеода в Торонто в
8. При синтезе инсулина в поджелудочной железе вначале образуется предшественник инсулина - проинсулин. Он состоит из А-цепи,
9. Инсулин был первым лекарственным рекомбинантным препаратом, полученным в промышленных масштабах еще в 1982 г.
10. До получения рекомбинантного инсулина препарат получали из поджелудочной железы свиней и крупного рогатого скота. Однако такой
11. Схема биосинтеза инсулина в β-клетках островков Лангерханса. ЭР - эндоплазматический ретикулум. 1 - образование сигнального пептида;
12. Модификация свиного инсулина синтетико-ферментативным методом Метод основан на том, что свиной инсулин отличается от инсулина человека
13. Генно – инженерный способ 2 пути: Раздельное получение обеих цепей (разные штаммы - продуценты) с последующим
14. Проинсулин
15. Химический синтез 1. Путем химического синтеза создаются последовательности нуклеотидов, которые кодируют образование А и В цепей
16. 6. Клетки лизируют, выделяют А и В цепи, которые связаны с бетагалактозидазой. Все это обрабатывают бромцианом
18. В 1975 г. У.Гилберт предложил следующую схему синтеза инсулина: Из опухолевых клеток поджелудочный железы выделяется мРНК
20. Следующий этап – включение гена предшественника инсулина (или генов цепей порознь) в геном E.coli – особого
21. В институте биоорганической химии РАН получен рекомбинантный инсулин (инсуран) с использованием генно-инженерных штаммов E.coli. Из выращенной
22. Получение рекомбинантного инсулина Культивирование штамма продуцента E.coli JM109/pPINS07 осуществляют в промышленном ферментере объемом 200-1500 л. Концентрацию
23. Известен способ получения рекомбинантного инсулина человека, предложенный J.Nilsson с соавторами Способ заключается в культивировании штамма-продуцента Е.
24. «+»: Идентичен по составу человеческому инсулину → нет аллергических реакций. Более экономичен по сравнению с животным
27. Скачать презентацию

Слайд 2

Инсулин - пептидный гормон, выделяемый β-клетками о. Лангенгарса.
Состоит из

двух пептидных цепей: А-цепь - из 21 аминокислотных остатков. В-цепь содержит 30 аминокислотных остатков. Эти две цепи связаны бисульфидными –S-S- связями, которые обеспечивают пространственную структуру белка инсулина.

Слайд 3

Слайд 4

История открытия инсулина связана с именем русского врача И.М. Соболева

(вторая половина 19 века), доказавшего, что уровень сахара в крови человека регулируется специальным гормоном поджелудочной железы.

В 1922 году инсулин, выделенный из поджелудочной железы животного, был впервые введен десятилетнему мальчику, больному диабетом результат превзошел все ожидания, и уже через год американская фирма «Eli Lilly» выпустила первый препарат животного инсулина.

Слайд 5

В 1935 году датский исследователь Хагедорн оптимизировал действие инсулина в

организме, предложив пролонгированный препарат.
Первые кристаллы инсулина были получены в 1952 году, а в в1954 году английский биохимик Г. Сенджер расшифровал структуру инсулина. Развитие методов очистки гормона от других гормональных веществ и продуктов деградации инсулина позволили получить гомогенный инсулин, называемый однокомпонентным.

Слайд 6

Инсулин был открыт Фредериком Бантингом и Чарльзом Бестом, работавшими в

лаборатории Дж. Маклеода в Торонто в 1921 г. Исследователи выделили инсулин из поджелудочной железы собаки и ввели его панкреатэктомированному животному с клиническими проявлениями СД, что привело к нормализации уровня сахара и купировало симптомы диабета. Нобелевская премия 1923 г. по медицине была присуждена Бантингу и Маклеоду.

Слайд 7

Слайд 8

При синтезе инсулина в поджелудочной железе вначале образуется предшественник инсулина

- проинсулин. Он состоит из А-цепи, В-цепи и С-пептида, состоящего из 35 аминокислотных остатков.
С-пептид отщепляется под действием карбоксипептидазы и трипсина и проинсулин переходит в активный инсулин.

Слайд 9

Инсулин был первым лекарственным рекомбинантным препаратом, полученным в промышленных масштабах

еще в 1982 г.

Слайд 10

До получения рекомбинантного инсулина препарат получали из поджелудочной железы свиней

и крупного рогатого скота. Однако такой способ получения инсулина имел целый ряд недостатков:
недостаток поголовья скота;
сложности хранения и транспортировки сырья;
трудности выделения и очистки гормона;
возможность развития аллергических реакций.

Слайд 11

Схема биосинтеза инсулина в β-клетках островков Лангерханса.
ЭР - эндоплазматический ретикулум.
1

- образование сигнального пептида;
2 - синтез препроинсулина;
3 - отщепление сигнального пептида;
4 - транспорт проинсулина в аппарат Гольджи; 5 - превращение проинсулина в инсулин и С-пептид и включение инсулина и С-пептида в секреторные гранулы; 6 - секреция инсулина и С-пептида.

Слайд 12

Модификация свиного инсулина синтетико-ферментативным методом
Метод основан на том, что свиной

инсулин отличается от инсулина человека одной заменой на С-конце В-цепи Ala30Thr. Замену аланина на треонин осуществляют путем катализируемого ферментом отщепления аланина и присоединение вместо него защищенного по карбоксильной группе остатка треонина, присутствующего в реакционной смеси в большом избытке. После отщепления защитной О-трет-бутильной группы получают инсулин человека.

Слайд 13

Генно – инженерный способ
2 пути:
Раздельное получение обеих цепей (разные штаммы -

продуценты) с последующим фолдингом (образование дисульфидных мостиков), разделение изоформ
Получение в виде предшественника (проинсулина) с последующим ферментативным расщеплением трипсином и карбоксипептидазой В до активной формы гормона

Слайд 14

Проинсулин

Слайд 15

Химический синтез
1. Путем химического синтеза создаются последовательности нуклеотидов, которые кодируют

образование А и В цепей (создание синтетических генов).
2. Каждый из синтетических генов вводят в плазмиды (в одну плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь А, в другую плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь В).
3. Вводят ген, кодирующий образование фермента бетагалактозидазы. Этот ген включают в каждую плазмиду для того, чтобы добиться активной репликации плазмид.
4. Плазмиды вводят в клетку E. coli- кишечной палочки и получают две культуры продуцента, одна культура синтезирует А-цепь, вторая В-цепь.
5. Помещают две культуры в ферментер. В среду добавляют галактозу, которая индуцирует образование фермента бетагалактозидазы. При этом плазмиды активно реплицируются, образуя много копий плазмид и, следовательно, много генов, синтезирующих Аи В цепи.

Слайд 16

6. Клетки лизируют, выделяют А и В цепи, которые связаны

с бетагалактозидазой. Все это обрабатывают бромцианом и отщепляют А и В-цепи от бетагалактозидазы. Затем производят дальнейшую очистку и выделение А и В цепей.
7. Окисляют остатки цистеина, связывают и получают инсулин.
Недостатки подобного метода: надо получать два отдельных штамма-продуцента, проводить две ферментации, две процедуры выделения и очистки, а самое главное, трудно обеспечить правильное замыкание дисульфидных связей, то есть получить активный инсулин.

Слайд 17

Слайд 18

В 1975 г. У.Гилберт предложил следующую схему синтеза инсулина:
Из

опухолевых клеток поджелудочный железы выделяется мРНК инсулина.
С помощью обратной транскриптазы мРНК получают кДНК.
Полученную кДНК встраивают в плазмиду рBR322 E. Coli в среднюю часть гена пенициллинидазы.
Рекомбинантная плазмида содержит информацию о структуре проинсулина.
В результате трансляции мРНК в клетках синтезируется гибридный белок, содержащий последовательности пенициллинидазы и проинсулина.
Проинсулин выщепляли из данного белка трипсином.
Из проинсулина выделяется инсулин.

Слайд 19

Слайд 20

Следующий этап – включение гена предшественника инсулина (или генов цепей

порознь) в геном E.coli – особого штамма кишечной палочки, выращенного в лабораторных условиях. Эту задачу выполняет генная инженерия.
Из E.coli вычленяют плазмиду соответствующей рестриктазой. синтетический ген встраивается в плазмиду (клонированием с функционально активной С-концевой частью β-галактозидазы E.coli). В результате E.coli приобретает способность синтезировать белковую цепь, состоящую из галактозидазы и инсулина. Синтезированные полипептиды отщепляют от фермента химическим путем, затем проводят и очистку. В бактериях синезируется около 100000 молекул инсулина на бактериальную клетку.

Слайд 21

В институте биоорганической химии РАН получен рекомбинантный инсулин (инсуран) с использованием

генно-инженерных штаммов E.coli. Из выращенной биомассы выделяется предшественник, гибридный белок, экспрессируемый в количестве 40% от всего клеточного белка, содержащий препроинсулин. Превращение его в инсулин in vitro осуществляется в той же последовательности, что и in vivо – отщепляется лидирующий полипептид, препроинсулин превращается в инсулин через стадии окислительного сульфитолиза с последующим восстановительным замыканием трех дисульфидных связей и ферментативным вычленением связывающего С-пептида. После ряда хромотографических очисток, включающих ионообменные, гелевые и ВЭЖХ, получают человеческий инсулин высокой чистоты и природной активности.

Слайд 22

Получение рекомбинантного инсулина
Культивирование штамма продуцента E.coli JM109/pPINS07 осуществляют в промышленном

ферментере объемом 200-1500 л.
Концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне 40±15%. После разрушения клеток дезинтеграцией тельца включения растворяют в буфере, содержащем 8 М мочевину, затем добавляют дитиотреитол. Ренатурацию гибридного белка инсулина проводят в одну стадию путем инкубации в 5-10-кратном объеме буфера до стадии очистки путем кислотного осаждения.
Гибридный белок хроматографируют на КМ-сефарозе. Ферментативное расщепление осуществляют последовательно при соотношении трипсин : гибридный белок и карбоксипептидаза Б : гибридный белок - 1:(500-1000).
Между стадиями расщепления гибридного белка трипсином и карбоксипептидазой Б проводят хроматографию на СП-сефарозе. Инсулин очищают методом препаративной обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии с последующей гель-фильтрацией и выделением в присутствии солей цинка. Изобретение позволяет упростить получение высокоочищенного рекомбинантного инсулина человека и повысить его выход в промышленном масштабе.

Слайд 23

Известен способ получения рекомбинантного инсулина человека, предложенный J.Nilsson с соавторами
Способ

заключается в культивировании штамма-продуцента Е. coli, продуцирующего проинсулин, содержащий два синтетических IgG связывающих домена стафилококкового белка А.
Выход проинсулина составлял 3 г/л питательной среды. Схема выделения заключалась в разрушении бактериальных клеток, получении телец включения, содержащих проинсулин, растворении телец включения, окислительного сульфитолиза проинсулина, его ренатурации, очистке ренатурированного белка аффинной хроматографией на IgG-Sepharose, расщеплении проинсулина протеолитическими ферментами (трипсином и карбоксипептидазой Б) и заключительной очистке инсулина высокоэффективной обращенно-фазовой жидкостной хроматографией.
Недостатками данного способа являются:
использование богатой питательной среды для выращивания микроорганизма, длительное (около 34 ч) время выращивания, высокая себестоимость целевого продукта, обусловленная использованием для очистки аффинного сорбента, дорогого в производстве и недолговечного при промышленном использовании. Недостатком можно также считать использование в технологии получения инсулина детергента Tween 20. Известно, что использование детергентов при выделении белков приводит к их сорбции на белок и присутствию детергента в конечном продукте.

Слайд 24

«+»:
Идентичен по составу человеческому инсулину → нет аллергических реакций.

Более экономичен по сравнению с животным инсулином (1 кг инсулина можно получить в 25 кубовом ферментере, используя кишечную палочку, или необходимо 35 тыс. голов с/х животных.
«-»:
Тщательный контроль выделения и очистки, т.к. примесь микробных липо- и глико-протеинов, обладают пирогенными свойствами.

Слайд 25

Рекомбинантный инсулин

Содержание

Инсулин - пептидный гормон, выделяемый β-клетками о. Лангенгарса. Состоит из

История открытия инсулина связана с именем русского врача И.М. Соболева

В 1935 году датский исследователь Хагедорн оптимизировал действие инсулина в

Инсулин был открыт Фредериком Бантингом и Чарльзом Бестом, работавшими в

При синтезе инсулина в поджелудочной железе вначале образуется предшественник инсулина

Инсулин был первым лекарственным рекомбинантным препаратом, полученным в промышленных масштабах

До получения рекомбинантного инсулина препарат получали из поджелудочной железы свиней

Схема биосинтеза инсулина в β-клетках островков Лангерханса.ЭР - эндоплазматический ретикулум. 1

Модификация свиного инсулина синтетико-ферментативным методом Метод основан на том, что свиной

Генно – инженерный способ2 пути:Раздельное получение обеих цепей (разные штаммы -

Проинсулин

Химический синтез 1. Путем химического синтеза создаются последовательности нуклеотидов, которые кодируют