Инженерная энзимология новый

Август 10, 2022

Главная
Разное
Инженерная энзимология новый

Содержание

7. Проблемы возникающие при использовании ферментов в биотехнологических процессах: Повышенные температуры Экстремальные значения pH Высокие концентрации органических
8. Основные подходы для стабилизации ферментов : Добавление стабилизирующих веществ в среду, в которой хранится фермент или
9. Стабилизация ферментов с помощью: Субстратов или их аналогов: Фермент-субстратный комплекс часто более устойчив, чем свободный фермент.
10. Стабилизация ферментов с помощью: 2. Органических растворителей: Многоатомные спирты стабилизируют некоторые ферменты за счет повышения устойчивости
11. Стабилизация ферментов с помощью: 3. Солей: При низких концентрациях солей ( Са2+ способен стабилизировать третичную структуру
13. Глюкоамилаза
14. Лактатдегидрогеназа
15. β-галактозидаза
16. Химическая модификация фермента 1. Фермент принимает более стабильную конформацию. 2. Введение в белок новых функциональных групп
24. Иммобилизация фермента позволяет: Повысить устойчивость фермента (нагреванию, автолизу, действию агрессивных сред и т. д) Многократно использовать
25. Иммобилизованные ферменты – это препараты ферментов, молекулы которых связаны с носителем, сохраняя при этом полностью или
26. Методы иммобилизации: В качестве носителей могут применяться: 1)Органические материалы: 1.1) природные (полисахариды, белки, липиды) 1.2) синтетические
27. Методы физической иммобилизации: 1) адсорбция фермента на нерастворимом носителе в результате электростатических, гидрофобных, вандер-ваальсовых и др.
29. Методы физической иммобилизации: 1)адсорбция фермента на нерастворимом носителе Достигается путем контакта водного раствора фермента с носителем.
30. Методы физической иммобилизации: 1)адсорбция фермента на нерастворимом носителе Факторы влияющие на адсорбцию: Удельная поверхность и пористость
31. Методы физической иммобилизации: 1)адсорбция фермента на нерастворимом носителе Преимущества: Относительная простота методики Доступность носителей Недостатки: Недостаточная
32. Методы физической иммобилизации: 2) включение фермента в полупроницаемую капсулу, в полупроницаемую мембрану
33. Липосомы — сферические везикулы (пузырьки), имеющие один или несколько липидных бислоёв. Образуются в смесях фосфолипидов с
34. Методы физической иммобилизации: 2) включение фермента в полупроницаемую капсулу, в полупроницаемую мембрану Преимущества: Относительная простота методики
35. Методы физической иммобилизации: 3) механическое включение фермента в гелевые структуры Фермент включается в трехмерную сетку полимерных
37. Методы физической иммобилизации: 3) механическое включение фермента в гелевые структуры Необходимо учитывать: Соответствие размера пор размеру
38. Методы физической иммобилизации: 3) механическое включение фермента в гелевые структуры Преимущества: Относительная простота методики Повышенная механическая,
39. Методы физической иммобилизации: 4) Включение в двухфазную систему Фермент растворим только в одной из фаз, а
41. Методы химической иммобилизации: Образовании ковалентных связей между ферментом и носителем. Преимущества: 1) Высокая прочность конъюгата 2)
42. При иммобилизации ферментов необходимо соблюдать следующие условия: 1. Активные группы матрицы не должны блокировать каталитический центр
51. Весьма перспективным является использование в качестве биокатализаторов иммобилизованных клеток. Т.к. можно избежать: дорогостоящие стадии выделения и
54. https://zen.yandex.ru/video/watch/602c8a1e2ca49f59481a6792 - химозин, пр-во сыра
56. Термофильные и гипертермофильные микроорганизмы продуцируют ферменты, которые называются термозимы (Zeikus et al 1998). Они имеют ряд
57. Термозимы Стабильны в условиях высокой температуры, высоких концентраций солей и экстремальных значений рН. Гипертермофильные микроорганизмы, встречающиеся
58. Механизмы ответственны за термоустойчивость ферментов у термозимов: Между мезофильными и термофильными версиями ферментов - высокая степень
59. Было обнаружено, что дегидрогеназа из Pyrococcus furiosus (Tm == 105 °C) содержит 35 изолейцинов, в то
60. Возросшая термостабильность коррелирует: с увеличением жесткости белковой структуры за счет уменьшения содержания остатков глицина, с улучшением
62. Механизмы стабилизации: • минимизация доступной площади гидрофобной поверхности белка; • оптимизация упаковки атомов белковой молекулы (минимизация
63. Применение ферментов из экстремофилов Современные технологии молекулярной биологии и генной инженерии позволяет: 1) получать достаточные количества
64. Применение ферментов из экстремофилов: Крахмал используется для производства сахаров. Сначала процесс ведется при (95–105 °С) и
65. Применение ферментов из экстремофилов: Наиболее термостабильные α-амилазы были обнаружены у archaea Pyrococcus woesei, Pyrococcus furiosus, Desulfurococcus
66. Применение ферментов из экстремофилов: Протеолитические ферменты Сериновые щелочные протеиназы широко используются в качестве добавок к моющим
67. Применение ферментов из экстремофилов: ДНК-полимеразы Термостабильные ДНК-полимеразы используются в ПЦР и играют важную роль в генной
68. ФЕРМЕНТЕР Ферментер - это специальный резервуар, внутри которого создаются идеальные условия для культивирования полезных микроорганизмов в
71. Скачать презентацию

Слайд 2

Слайд 3

Слайд 4

Слайд 5

Слайд 6

Слайд 7

Проблемы возникающие при использовании ферментов в биотехнологических процессах:
Повышенные температуры
Экстремальные значения pH

Высокие концентрации органических растворителей или ПАВ.
Невозможность многократно использовать фермент.
Сложность при разделении фермента от продукта.

Слайд 8

Основные подходы для стабилизации ферментов :
Добавление стабилизирующих веществ в среду, в

которой хранится фермент или проводится ферментативная реакция.
2. Химическая модификация фермента.
3. Иммобилизация фермента.

Слайд 9

Стабилизация ферментов с помощью:
Субстратов или их аналогов:
Фермент-субстратный комплекс часто

более устойчив, чем свободный фермент.
Пример: фермент лактатдегидрогеназа в присутствии лактата более термоустойчив.

Слайд 10

Стабилизация ферментов с помощью:
2. Органических растворителей:
Многоатомные спирты стабилизируют некоторые ферменты

за счет повышения устойчивости внутримолекулярных водородных связей белка.
Пример: химотрипсин в присутствии 50–90 % глицерина более устойчив к протеолизу

Слайд 11

Стабилизация ферментов с помощью:
3. Солей:
При низких концентрациях солей (<0,1M) катионы Са2+,

Zn2+, Mn2+,Fe2+ и др. могут специфично взаимодействовать с металлопротеинами.
Са2+ способен стабилизировать третичную структуру ряда белков (благодаря образованию ионных связей с двумя различными аминокислотными остатками).
Пример: у α-Амилазы (из Вacillus caldolyticus)
Са2+ значительно повышает термическую устойчивость.

Слайд 12

Слайд 13

Глюкоамилаза

Слайд 14

Лактатдегидрогеназа

Слайд 15

β-галактозидаза

Слайд 16

Химическая модификация фермента
1. Фермент принимает более стабильную конформацию.
2. Введение в белок

новых функциональных групп приводит к образованию дополнительных стабилизирующих водородных связей или иных слабых взаимодействий.
3. При использовании неполярных соединений усиливаются гидрофобные взаимодействия.
4. Модификация гидрофобных областей поверхности белка гидрофильными соединениями уменьшает площадь неблагоприятного контакта внешних неполярных остатков с водой.

Слайд 17

Слайд 18

Слайд 19

Слайд 20

Слайд 21

Слайд 22

Слайд 23

Слайд 24

Иммобилизация фермента позволяет:
Повысить устойчивость фермента (нагреванию, автолизу, действию агрессивных сред и

т. д)
Многократно использовать фермент
Отделять фермент от реагентов и продуктов реакции.
Прерывать реакцию в нужный момент.

Слайд 25

Иммобилизованные ферменты – это препараты ферментов, молекулы которых связаны с носителем,

сохраняя при этом полностью или частично свои каталитические свойства.
Методы иммобилизации:
Химические
Физические

Слайд 26

Методы иммобилизации:
В качестве носителей могут применяться:
1)Органические материалы:
1.1) природные (полисахариды, белки, липиды)

1.2) синтетические полимерные носители
2) Неорганические материалы (матрицы на основе силикагеля, глины, керамики, природных минералов и т. д.)

Слайд 27

Методы физической иммобилизации:
1) адсорбция фермента на нерастворимом носителе в результате электростатических,

гидрофобных, вандер-ваальсовых и др. взаимодействий;
2) включение фермента в полупроницаемую капсулу, в полупроницаемую мембрану;
3) механическое включение фермента в гелевые структуры;
4) Включение в двухфазную систему.

Слайд 28

Слайд 29

Методы физической иммобилизации:
1)адсорбция фермента на нерастворимом носителе
Достигается путем контакта водного раствора

фермента с носителем.

Слайд 30

Методы физической иммобилизации:
1)адсорбция фермента на нерастворимом носителе
Факторы влияющие на адсорбцию:
Удельная поверхность

и пористость носителя
Значение рН (на не ионообменниках мах адсорбция в изоэлектрической точке белка)
Ионная сила раствора (возрастание ионной силы –десорбция фермента, но иногда обратная ситуация “высаливание”)
Концентрация фермента.
Температура ( с одной стороны денатурация, с другой - ускоренная диффузия)

Слайд 31

Методы физической иммобилизации:
1)адсорбция фермента на нерастворимом носителе
Преимущества:
Относительная простота методики
Доступность носителей
Недостатки:
Недостаточная прочность

связывания
Многие носители биодеградируемы

Слайд 32

Методы физической иммобилизации:
2) включение фермента в полупроницаемую капсулу, в полупроницаемую мембрану

Слайд 33

Липосомы — сферические везикулы (пузырьки), имеющие один или несколько липидных бислоёв.

Образуются в смесях фосфолипидов с водой.

Слайд 34

Методы физической иммобилизации:
2) включение фермента в полупроницаемую капсулу, в полупроницаемую мембрану
Преимущества:
Относительная

простота методики
Защита от микроорганизмов
Нет диффузионных ограничений (т.к. отношение поверхности к площади велико и толщина мембраны невелика)
Недостатки:
Биодеградируемы
Не применим для высокомолекулярных субстратов

Слайд 35

Методы физической иммобилизации:
3) механическое включение фермента в гелевые структуры
Фермент включается в

трехмерную сетку полимерных цепей, образующих гель.

Слайд 36

Слайд 37

Методы физической иммобилизации:
3) механическое включение фермента в гелевые структуры
Необходимо учитывать:
Соответствие размера

пор размеру фермента.
Природа матрицы (т.к. она создает микроокружение для фермента, может создавать рН отличное от рН раствора и повышать сродство субстрата к матрице, что повышает скорость ферментативной реакции )

Слайд 38

Методы физической иммобилизации:
3) механическое включение фермента в гелевые структуры
Преимущества:
Относительная простота методики
Повышенная

механическая, химическая и тепловая стойкость матриц.
3) Происходит стабилизация фермента
4) Фермент защищен от бактериального повреждения
Недостатки:
1) Не применим для высокомолекулярных субстратов

Слайд 39

Методы физической иммобилизации:
4) Включение в двухфазную систему
Фермент растворим только в одной

из фаз, а продукт - в другой
Позволяет работать в высокомолекулярными субстратами.

Слайд 40

Слайд 41

Методы химической иммобилизации:
Образовании ковалентных связей между ферментом и носителем.
Преимущества:
1) Высокая прочность

конъюгата
2) Можно повышать стабильность фермента

Слайд 42

При иммобилизации ферментов необходимо соблюдать следующие условия:
1. Активные группы матрицы не

должны блокировать каталитический центр фермента.
2. Иммобилизации не должны приводить к потере активности фермента.

Слайд 43

Слайд 44

Слайд 45

Слайд 46

Слайд 47

Слайд 48

Слайд 49

Слайд 50

Слайд 51

Весьма перспективным является использование в качестве биокатализаторов иммобилизованных клеток.
Т.к. можно избежать:
дорогостоящие

стадии выделения и очистки ферментов
2) необходимости их последующей стабилизации

Слайд 52

Слайд 53

Слайд 54

https://zen.yandex.ru/video/watch/602c8a1e2ca49f59481a6792 - химозин, пр-во сыра

Слайд 55

Слайд 56

Термофильные и гипертермофильные микроорганизмы продуцируют ферменты, которые называются термозимы (Zeikus et

al 1998).
Они имеют ряд биотехнологических преимуществ перед мезофильными аналогами.
1. Работа с более высокими концентрациями субстрата из-за снижения вязкости раствора и увеличения коэффициентов диффузии.
2. Снижение риска побочных процессов.
3. Устойчивость к денатурирующим агентам, например, растворителям.
4. Простота очистки термозимов методом термообработки.

Слайд 57

Термозимы
Стабильны в условиях высокой температуры, высоких концентраций солей и экстремальных значений

рН.
Гипертермофильные микроорганизмы, встречающиеся среди Archaea и Bacteria, живут при температурах 80–100 °С.

Слайд 58

Механизмы ответственны за термоустойчивость ферментов у термозимов:
Между мезофильными и термофильными версиями

ферментов - высокая степень гомологии последовательности и структуры.
Так, последовательности термостабильных дегидрогеназ из Pyrococcus и Thermotoga на 35 и 55% соответственно идентичны последовательности мезофильной дегидрогеназы из Clostridium.

Слайд 59

Было обнаружено, что дегидрогеназа из Pyrococcus furiosus (Tm == 105 °C)

содержит 35 изолейцинов, в то время как дегидрогеназы из Thermotoga maritima (Tm = 95 °C) и Clostridium symbiosum (Tm = 55 °C) только 21 и 20 изолейцинов соответственно.
Термостабильные ферменты содержат меньше глицина: Cs дегидрогеназа содержит 48 остатков глицина, а дегидрогеназы из Tm и Pf только
39 и 34 глицина соответственно.
Больше изолейцина и меньше глицина.

Слайд 60

Возросшая термостабильность коррелирует:
с увеличением жесткости белковой структуры за счет уменьшения содержания

остатков глицина,
с улучшением гидрофобных контактов в ядре дегидрогеназы из Pf в результате замены валина изолейцином. (В результате сайт-направленного мутагенеза приводящего к замене изолейцина на валин термостабильность мутантов уменьшалась).

Слайд 61

Слайд 62

Механизмы стабилизации:
• минимизация доступной площади гидрофобной поверхности белка;
• оптимизация упаковки атомов

белковой молекулы (минимизация отношения поверхность/объем);
• оптимизация распределения зарядов (достигается благодаря устранению отталкивающих взаимодействий, а также в результате организации взаимодействий между зарядами в своеобразную сеть)
Уменьшение количества впадин

Слайд 63

Применение ферментов из экстремофилов
Современные технологии молекулярной биологии и генной инженерии позволяет:
1)

получать достаточные количества ферментов из экстремофилов для их последующего
анализа и практического применения.
2)клонирование и экспрессия этих ферментов в мезофильных организмах.

Слайд 64

Применение ферментов из экстремофилов:
Крахмал используется для производства сахаров. Сначала процесс ведется

при (95–105 °С) и при значениях рН 6–6,5.
На следующем этапе температура снижается до 60°С и рН=4,5.
Использование термостабильных ферментов (α-амилазы, глюкоамилазы, ксилозоизомеразы), выделенных из гипертермофилов, позволит:
проводить процесс в одну стадию и при одних и тех же условиях
отказаться от дорогостоящих ионообменников

Слайд 65

Применение ферментов из экстремофилов:
Наиболее термостабильные α-амилазы были обнаружены у archaea Pyrococcus

woesei,
Pyrococcus furiosus, Desulfurococcus mucosus, Pyrodictium abyssi и Staphylothermus
marinus. Гены амилазы из Pyrococcus sp. были
клонированы и экспрессированы в E.coli и Bacillus subtilis.

Слайд 66

Применение ферментов из экстремофилов:
Протеолитические ферменты
Сериновые щелочные протеиназы широко используются в качестве

добавок к моющим средствам.
Протеиназы из экстремофилов сохраняют нативность при высоких температурах, в присутствии высоких концентраций детергентов и других денатурирующих агентов. Pyrococcus, Thermococcus, Staphylothermus, Desulfurococcus и Sulfolobus. Максимальную активность эти ферменты проявляют при температурах
от 90 до 110 °С и значениях рН от 2 до 10

Слайд 67

Применение ферментов из экстремофилов:
ДНК-полимеразы
Термостабильные ДНК-полимеразы используются в ПЦР и играют важную

роль в генной инженерии. Термостабильные полимеразы были обнаружены у гипертермофилов Pyrococcus furiosus и Pyrococcus litoralis, а также у термофилов Thermus aquaticus.

Слайд 68

ФЕРМЕНТЕР
Ферментер - это специальный резервуар, внутри которого создаются идеальные условия для

культивирования полезных микроорганизмов в питательной среде.
Через среду пропускают насыщенный кислородом воздух, и в ходе перемешивания масса становится однородной.
Типовые ферментеры представляют собой вертикальные ёмкости различной вместимости (малые от 1 до 10 л, многотоннажные более 1000 л)
https://www.youtube.com/watch?v=epWDByKHGEU

Слайд 69

Инженерная энзимология новый

Содержание

Проблемы возникающие при использовании ферментов в биотехнологических процессах:Повышенные температурыЭкстремальные значения pH

Основные подходы для стабилизации ферментов :Добавление стабилизирующих веществ в среду, в

Стабилизация ферментов с помощью:Субстратов или их аналогов: Фермент-субстратный комплекс часто

Стабилизация ферментов с помощью:2. Органических растворителей: Многоатомные спирты стабилизируют некоторые ферменты

Стабилизация ферментов с помощью:3. Солей:При низких концентрациях солей (<0,1M) катионы Са2+,

Глюкоамилаза

Лактатдегидрогеназа

β-галактозидаза

Химическая модификация фермента1. Фермент принимает более стабильную конформацию.2. Введение в белок

Иммобилизация фермента позволяет:Повысить устойчивость фермента (нагреванию, автолизу, действию агрессивных сред и

Иммобилизованные ферменты – это препараты ферментов, молекулы которых связаны с носителем,

Методы иммобилизации:В качестве носителей могут применяться:1)Органические материалы:1.1) природные (полисахариды, белки, липиды)

Методы физической иммобилизации:1) адсорбция фермента на нерастворимом носителе в результате электростатических,

Методы физической иммобилизации:1)адсорбция фермента на нерастворимом носителеДостигается путем контакта водного раствора

Методы физической иммобилизации:1)адсорбция фермента на нерастворимом носителеФакторы влияющие на адсорбцию:Удельная поверхность

Методы физической иммобилизации:2) включение фермента в полупроницаемую капсулу, в полупроницаемую мембрану

Липосомы — сферические везикулы (пузырьки), имеющие один или несколько липидных бислоёв.

Методы физической иммобилизации:2) включение фермента в полупроницаемую капсулу, в полупроницаемую мембрануПреимущества:Относительная

Методы физической иммобилизации:3) механическое включение фермента в гелевые структурыФермент включается в

Методы физической иммобилизации:3) механическое включение фермента в гелевые структурыНеобходимо учитывать:Соответствие размера

Методы физической иммобилизации:3) механическое включение фермента в гелевые структурыПреимущества:Относительная простота методикиПовышенная

Методы физической иммобилизации:4) Включение в двухфазную системуФермент растворим только в одной

Методы химической иммобилизации:Образовании ковалентных связей между ферментом и носителем.Преимущества:1) Высокая прочность

При иммобилизации ферментов необходимо соблюдать следующие условия:1. Активные группы матрицы не

Весьма перспективным является использование в качестве биокатализаторов иммобилизованных клеток.Т.к. можно избежать:дорогостоящие