Биотехнология растений. Трансгенные растения (часть 4)

Лекция 6: Трансгенные растения-4

Получение инсерционных мутантов растений на основе агробактериальной трансформации
Клонирование

Т-ДНК инсерционный мутагенез

интеграция Т-ДНК

изменение структуры одного из генов за счет встраивания

Схемы используемых плазмид для получения:

рецессивных мутаций

доминантных мутаций

X - усилители транскрипции из

Клонирование генов

Клонирование гена agamous с помощью Т-ДНК инсерционного мутагенеза

ЭМС-мутагенез

10 лепестков,
4 чашелистика

агробактериальная

Ген, маркированный транспозоном (tagged gene), можно клонировать с помощью «вытягивания за

Транспозонный мутагенез

интеграция изменение структуры ….изменение транспозона одного из генов…. фенотипа

Возможность клонировать
ген,

При встраивании транспозона в кодирующую последовательность гена, наблюдается мутантный фенотип.
При

Клонирование генов на основе транспозонного (инсерционного) мутагенеза

Клонирование генов на основе транспозонного (инсерционного) мутагенеза

Получение мутации flo613 и клонирование гена FLORICAULA львиного зева (Coen et

Рестрикционный анализ ДНК из выделенных клонов, необходимый для выявления участков

Создание геномной библиотеки из мутанта flo 613, выращиваемого при tº=25ºC (Тam3

Скрининг библиотеки с меченой пробой из Tam3 для выявления клонов, содержащих

Д.т. flo 613
9.0
5.5
1.5

Сравнение рестрикционных карт клонов, содержащих ген FLO, из

Ген FLORICAULA – уникальный ген, присутствующий в геноме покрытосеменных в 1

Изучение механизмов регуляции экспрессии генов растений с использованием репортерных (индикаторных)

Слитые гены-репортеры

К промотору исследуемого гена присоединяют репортерный ген

Green fluorescent protein (GFP)

Luciferase (LUC)

ß-glucuronidase (GUS)

Promoter-reporter fusion:
Использование гибридных конструкций, содержащих
репортерный

В трансформированных растениях проводят анализ экспрессии репротерного гена, отбирают трансформантов с

Анализ распределение ауксина в растениях с помощью генетической конструкции DR5:GUS

DR5 –

Анализ активности промоторов ключевых регуляторных генов в меристемах растений

Получение растений со сверхэкспрессией гена с целью изучения функции гена

Фенотип трансгенных растений 35S::LFY

У растений 35S::LFY ген LFY экспрессируется и в

Характер экспрессии генов-ортологов LFY/FLO может определять тип соцветия (открытое или закрытое)

Метод позволяет изучить регуляторную функцию любого участка гена

Направленный мутагенез промоторной области

Мутант арабидопсиса по гену LFY

Основные семейства транскрипционных факторов растений

Консервативные для эукариот:

Уникальные для растений:

ТФ с MADS-доменом
ТФ

Гомеодомен-ДНК - комплекс

вариабельный уч.

гомеодомен

N

С

Структура транскрипционного фактора с ДНК-связывающим гомеодоменом

Гены семейств KNOX (STM) и WOX (WUS) кодируют гомеодомен-содержащие транскрипционные факторы

Гены

ТФ с гомеодоменами
(семейство TALE)

KNOX

мишени: гены биосинтеза ЦК и ГК
программы развития:
1). Развитие

Ген KNOTTED1 был идентифи-цирован на основе доминантных мутаций kn1, вызывающих отсутствие

Зная о важной роли гомеобоксных генов в развитии животных, приступили к

Сверхэкспрессия гена KNAT1 у арабидопсиса

На листьях возникали дополнительные меристематические очаги, из

Сверхэкспрессия гена KNAT в листьях томатов

дикий тип

35S::KNAT

KNOTTED-подобные гены – возможные участники морфологической эволюции растений

Обнаружение связи между уровнем экспрессии KNOX-генов и усложнением структуры листа позволило

MCM1 – регулятор транскрипции дрожжей
AG – гомеозисный ген арабидопсиса (класс С)
DEF

ТФ с MADS доменом

вышележащие регуляторы: ТФ LFY
мишени: ???
программы развития: развитие

Исследования трансгенных растений с конститутивной экспрессией гомеозисных генов также доказывают верность

Цветки с двойным венчиком (лилейные)

Цветки с двойной чашечкой

Мутации в АВС-

Использование методов «генетической хирургии» для изучения взаимодействия клеток и тканей в

Day, Galgoci, Irish, 1995. Генетическое удаление лепестков и тычинок для выяснения

«Пространственная» модель Holder, 1979. Под влиянием позиционных сигналов происходит разметка ФМ,

В основе «генетической хирургии» лежит метод трансформации растений химерными генами следующей

гены, кодирующие рибонуклеазы: Т1 рибонуклеазу Aspergillus oryzae и барназу Bacillus amyloliquefaciens,

Целью работы Day, Galgoci, Irish (1995) была проверка существующих моделей с

Этапы работы

Слитые гены включали в Т-ДНК область (фрагмент Ti-плазмиды,который передается растению)

У резушки получено 5 трансгенных растений, в геноме которых присутствовали от

Использование трансформации для изучения роли гормонов в развитиии растений

Корончатый галл на растении табака как результат трансформации агробактерией (штамм дикого

Трансгенные рстения с геном tmr

Ген tmr в трансгенных растениях, экспрессирующийся в плодах (промотор 2А11)

Опухолеобразование у редиса – генетический признак

Фенокопии опухолеобразования у трансгенных растений с геном ipt

Прямая генетика: фенотип ген Обратная генетика: ген фенотип

Прямая и обратная генетика в

- гомологичная рекомбинация/замещение гена -замещение гена: альтернативные подходы (Zn-fingers nucleases, TALEN) - РНК-интерференция/

TALE: TAL (transcription activator-like) effectors

Эффекторы TALE – регуляторные белки, секретируются бактериями

Основные типы замолкания гена (сайленсинга)

пост-транскрипционный сайленсинг
(регуляция экспресии гена на уровне трансляции)
PTGS

Белки, участвующие в метаболизме «малых» РНК у растений

DCL1 (DICER-like) –

Пример: выключение (сайленсинг) гена «икс»

конститутивный
(35S)

регулируемый
(индуцибельный)

Интроны

промотор

икс

ски

dsRNA

RISC –
RNA-induced
silencing

Регулируемое замолкание гена PDS (PHYTOENE DEASATURASE)

LB

RB

RB

LB

35S

LhGR

GUS

op

PDS

PDS

intron

pHELLSTOP

PDS-
PHYTOENE DEASATURASE

оператор

b-глюкоронидаза

Нет ИНДУКТОРА

Добавление ИНДУКТОРА: + DEX дексаметазон

Регулируемое замолкание (индуцибельный сайленсинг) гена PDS (PHYTOENE DEASATURASE)

No Dex

Dex

Enhancer TATA

En En En En

Enhancer TATA

Enhancer TATA

3. Enhancer

Инсерционный мутагенез с использованием «ловушек» промоторов

Репортерный ген без промотора встраивают

Enhancer TATA

4. Ловушка для промотора (promoter trap) -1

reporter gene

гибридный белок

Принцип работы
«ловушки для энхансеров»
GAL4:GFP

Примеры использования Т-ДНК в качестве «зондов»

Методы редактирования генома растений

Модификации генома: разновидности

Изменение случайного места
в геноме

Редактирование генома

Редактирование генома

Инактивация конкретного локуса

Замена одного локуса на другой с помощью гомологичной

Программируемые нуклеазы

ZFN (Zink-Finger Nucleases)
TALENs (Transcription Activator-Like Effector Nucleases)
CRISPR-Cas система (Clustered regularly

Нуклеазы с цинковыми пальцами

В качестве ДНК-связывающего домена используется универсальный домен типа

Как программируют ZFN?

Wolfe et al., 1999

Каждый цинковый палец распознаёт 3 (4)

TALEN (Transcription Activator-Like Effectors Nucleases)

TALEN

Kim, Kim, 2014

33-35 аминокислотные повторы
12ый -13ый аминокислотные остатки (repeat variable

Применение TALEN

Потеря функции гена LOX3 (кодирует липоксигеназу, создающую перекись водорода) увеличивает

Система CRISPR/Cas9 (Clustered regularly Interspaced Palindromic Repeats- CRISPR associated protein)

Система CRISPR/Cas9
В 2005 обнаружили, что спейсеры гомологичны последовательностям фагов и конъюгативных

Работа системы CRISPR-Cas в бактериях

Horvath, Barrangou, 2010

Čermák et al., 2015

Защита от вирусов с помощью CRISPR-Cas9

Ji et al., 2015

Рецептор ауксина Auxin binding protein 1 (ABP1)

Chen et al., 2001

Gao et al., 2015