Детекция и идентификация биомолекул. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Содержание

Слайд 2

Полимеразная цепная реакция Метод ПЦР представляет собой синтез in vitro (в

Полимеразная цепная реакция

Метод ПЦР представляет собой синтез in vitro (в

пробирке) множества копий определенного целевого фрагмента ДНК, присутствующего в составе молекул ДНК в исследуемом образце, с помощью фермента ДНК-полимеразы при особом температурном режиме.

Выбор копируемого фрагмента ДНК и его границы определяются парой коротких синтетических олигонуклеотидов (праймеров), которые связываются с заданным участком в составе молекул ДНК в образце по принципу комплементарности, у его начала и конца, на противоположных цепях ДНК и служат затравками (началом) синтеза новых цепей.
Чувствительность метода такова, что позволяет обнаружить целевую последовательность, даже если она встречается однажды в образце из миллионов других молекул.

Слайд 3

Полимеразная цепная реакция Открытие метода ПЦР Основные принципы использования праймеров и

Полимеразная цепная реакция

Открытие метода ПЦР
Основные принципы использования праймеров и состав реакционной

смеси для получения копий ДНК впервые были описаны K. Kleppe с соавторами в 1971 г.
В 1983 г. сотрудник фирмы «Cetus» Kary Mullis предложил метод копирования (амплификации) определенных участков ДНК (метод ПЦР) в процессе повторяющихся температурных циклов.
1993 г. - Нобелевская премия по химии.
1985 г. - Saiki R.K. с соавторами опубликовали статью, в которой была описана амплификация участка гена β−глобина.

Kary Mullis

Слайд 4

Полимеразная цепная реакция Применение метода ПЦР 1. Диагностика (выявление, обнаружение)‏ -

Полимеразная цепная реакция

Применение метода ПЦР
1. Диагностика (выявление, обнаружение)‏
- диагностика инфекционных

заболеваний;
- диагностика онкологических заболеваний;
- диагностика генетических заболеваний;
- обнаружение микроорганизмов (в природных образцах, продуктах питания);
- обнаружение генномодифицированных организмов и их компонентов в
составе продуктов питания;
- обнаружение целевых генов.
2. Идентификация
- идентификация микроорганизмов;
- идентификация личности;
- установление родства.
3. Клонирование (сборка) генов, модификация генов
4. Исследование структуры генов и геномов
5. Мутагенез и изменение свойств природных белков
Слайд 5

Полимеразная цепная реакция Репликация (удвоение) ДНК ПЦР моделирует в пробирке природный

Полимеразная цепная реакция

Репликация (удвоение) ДНК
ПЦР моделирует в пробирке природный процесс репликации

ДНК.
Особенности процесса репликации:
1. Катализируется ДНК-полимеразами
2. Полуконсервативность
3. Необходимость в затравке
4. Комплементарность
5. Последовательность нуклеотидов в матричной цепи считывается в направлении 3'→5'
6. Новая (дочерняя) цепь синтезируется в направлении 5'→3'
Слайд 6

Полимеразная цепная реакция Репликация (удвоение) ДНК

Полимеразная цепная реакция

Репликация (удвоение) ДНК

Слайд 7

Полимеразная цепная реакция Оборудование для ПЦР ДНК-амплификаторы, ПЦР-амплификаторы, термоциклеры (thermocycler) –

Полимеразная цепная реакция

Оборудование для ПЦР
ДНК-амплификаторы, ПЦР-амплификаторы,
термоциклеры (thermocycler) – это устройства для

быстрого изменения температуры реакционной смеси по определенной программе.
Амплификаторы разделяются на:
- детектирующие амплификаторы (возможна регистрация синтеза копий фрагмента ДНК в ходе самой реакции);
- обычные амплификаторы (нет возможности регистрации хода процесса во время реакции).
Амплификаторы имеют:
- блоки с обычными крышками;
- блоки с крышками, температура которых меняется согласованно с температурой самого блока.
Слайд 8

Полимеразная цепная реакция Компоненты реакционной смеси 1. Деионизованная вода 2. Буфер

Полимеразная цепная реакция

Компоненты реакционной смеси
1. Деионизованная вода
2. Буфер для ДНК-полимеразы
3. Смесь

дезоксинуклеотидтрифосфатов
(дНТФ, dNTP)‏
4. Праймер 1 f (forward)‏
5. Праймер 2 r (reverse)‏
6. Образец ДНК
7. ДНК-полимераза
Слайд 9

Полимеразная цепная реакция Приготовление реакционной смеси

Полимеразная цепная реакция

Приготовление реакционной смеси

Слайд 10

Полимеразная цепная реакция Циклический температурный режим (программа амплификации)‏ 1 цикл –

Полимеразная цепная реакция

Циклический температурный режим (программа амплификации)‏
1 цикл – денатурация

(первоначальный прогрев
реакционной смеси) 91-950С 1-5 мин 1 раз
2 цикл – 25-30 раз
1) денатурация 91-950С 15-60 сек
2) отжиг
(связывание праймеров) Та 15-60 сек
(annealing)‏
3) элонгация (удлинение цепей) 720С t
30 сек на
500 нуклеотидов
3 цикл – окончательное достраивание
цепей 720С 5 мин 1 раз
4 цикл – охлаждение 4-100С до выключения
прибора
Слайд 11

Полимеразная цепная реакция Программа амплификации

Полимеразная цепная реакция

Программа амплификации

Слайд 12

Полимеразная цепная реакция Механизм полимеразной цепной реакции 1 цикл

Полимеразная цепная реакция

Механизм полимеразной цепной реакции
1 цикл

Слайд 13

Полимеразная цепная реакция Механизм полимеразной цепной реакции 2 цикл

Полимеразная цепная реакция

Механизм полимеразной цепной реакции
2 цикл

Слайд 14

Полимеразная цепная реакция Механизм полимеразной цепной реакции 3 цикл

Полимеразная цепная реакция

Механизм полимеразной цепной реакции 3 цикл

Слайд 15

Полимеразная цепная реакция Стадии постановки ПЦР

Полимеразная цепная реакция

Стадии постановки ПЦР

Слайд 16

Полимеразная цепная реакция Регистрация результатов ПЦР методом электрофореза в агарозном геле

Полимеразная цепная реакция

Регистрация результатов ПЦР
методом электрофореза в агарозном геле

Слайд 17

Полимеразная цепная реакция Специфичность (правильность) ПЦР

Полимеразная цепная реакция

Специфичность (правильность) ПЦР

Слайд 18

Полимеразная цепная реакция Требования к подбору праймеров 1. Длина праймера –

Полимеразная цепная реакция

Требования к подбору праймеров
1. Длина праймера – 17-28 нуклеотидов.
2.

Состав нуклеотидов в праймере должен быть таков, что
Tm = 4 (G+C) + 2 (A+T) должна лежать в диапазоне 55-75 0С.
3. На 3’- конце праймера должны быть нуклеотиды G, C, GC или CG.
4. Tm праймеров, работающих в паре, должна быть сходной.
5. На 3’- конце праймера не должно быть последовательностей из ССС или
GGG.
6. Четыре и более нуклеотидов на 3’- конце праймера не должны быть
комплементарны самому праймеру либо праймеру в паре.
7. С 5’-конца праймера может быть добавлена любая не комплементарная
матрице последовательность нуклеотидов любой длины.
Слайд 19

Полимеразная цепная реакция Добавление последовательностей нуклеотидов к копируемому фрагменту ДНК

Полимеразная цепная реакция

Добавление последовательностей нуклеотидов к копируемому фрагменту ДНК

Слайд 20

Полимеразная цепная реакция Специфичность ПЦР «Горячий старт»

Полимеразная цепная реакция

Специфичность ПЦР
«Горячий старт»

Слайд 21

Полимеразная цепная реакция Специфичность ПЦР «Горячий старт» 1. Разделение компонентов реакционной

Полимеразная цепная реакция

Специфичность ПЦР
«Горячий старт»
1. Разделение компонентов реакционной смеси барьером (прослойкой

парафина).
2. Внесение в реакционную смесь одного из компонентов реакции (ДНК-полимеразы) во время первого цикла после прогрева пробирки до температуры денатурации.
3. Ингибирование полимеразы антителами.
4. Использование химически модифицированной ДНК-полимеразы.
Слайд 22

Полимеразная цепная реакция Контроль за прохождением реакции ПЦР

Полимеразная цепная реакция

Контроль за прохождением реакции ПЦР

Слайд 23

Полимеразная цепная реакция Контроль за прохождением реакции ПЦР Положительный контроль 1.

Полимеразная цепная реакция

Контроль за прохождением реакции ПЦР

Положительный контроль
1. Деионизованная вода
2. Буфер

для ДНК-полимеразы
3. Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов
(дНТФ, dNTP)‏
4. Праймер 1 f (forward)‏
5. Праймер 2 r (reverse)‏
6. Образец ДНК, содержащий копируемый фрагмент
7. ДНК-полимераза

Отрицательный контроль
1. Деионизованная вода
2. Буфер для ДНК-полимеразы
3. Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов
(дНТФ, dNTP)‏
4. Праймер 1 f (forward)‏
5. Праймер 2 r (reverse)‏
6. Деионизованная вода
7. ДНК-полимераза

Слайд 24

Полимеразная цепная реакция Стадии постановки ПЦР

Полимеразная цепная реакция

Стадии постановки ПЦР

Слайд 25

Полимеразная цепная реакция Принцип организации ПЦР-лабораторий

Полимеразная цепная реакция

Принцип организации ПЦР-лабораторий

Слайд 26

Полимеразная цепная реакция Ферменты, используемые в ПЦР Taq-ДНК-полимераза Thermus aquaticus не

Полимеразная цепная реакция

Ферменты, используемые в ПЦР
Taq-ДНК-полимераза Thermus aquaticus не точный
Tth-ДНК-полимераза Thermus thermophilus не точный
Pwo-ДНК-полимераза Pyrococcus woesei точный
Pfu-ДНК-полимераза Pyrococcus

furiosus точный
AMV-обратная транскриптаза Аvian myeloblastosis virus
MMLV-обратная транскриптаза Moloney murine leukemia virus точный
Слайд 27

Полимеразная цепная реакция Ферменты, используемые в ПЦР Taq-полимераза была выделена из

Полимеразная цепная реакция

Ферменты, используемые в ПЦР
Taq-полимераза была выделена из термофильной эубактерии

Thermus aquaticus. Фермент представляет собой одну полипептидную цепь с молекулярной массой около 95 к Да. Это высокопроцессивный фермент (как правило, эффективно амилифицирующий фрагменты длиной до 3-5 т. п. н.) с хорошо выраженной 5'-3' экзонуклеазной активностью и без 3'-5' (корректирующей) экзонуклеазной активности. Получаемые при использовании Taq-полимеразы фрагменты ДНК, как правило, содержат выступающий 3'-концевой нуклеотид (чаще всего — аденозин), нематрично присоединяемый ферментом. Это свойство Taq-полимеразы используют для эффективного клонирования продуктов ПЦР в специально подготовленные линеаризованные вектора с 3'-выступающим тимидином.
Слайд 28

Полимеразная цепная реакция Ферменты, используемые в ПЦР Tth -полимераза была выделена

Полимеразная цепная реакция

Ферменты, используемые в ПЦР
Tth -полимераза была выделена из термофильной

эубактерии Thermus thermophilics. Это также высокопроцессивный фермент (дает фрагменты длиной до 3 т. п. н.) массой около 94 кДа с хорошо выраженной 5'-3' экзонуклеазной активностью и без З'-5' экзонуклеазной активности. Особенностью этой полимеразы является наличие ревертазной активности (способности использовать в качестве матрицы молекулы РНК). Данный фермент пытаются использовать для проведения обратной транскрипции и ПЦР в одной пробирке.
Слайд 29

Полимеразная цепная реакция Ферменты, используемые в ПЦР Pwo -полимераза была выделена

Полимеразная цепная реакция

Ферменты, используемые в ПЦР
Pwo -полимераза была выделена из гипертермофильной

архебактерии Pyrococcus woesei. Масса фермента около 90 кДа. Это процессивный фермент (дает фрагменты до 3 т. п. н.) без 5' -3' экзонуклеазной активности и с хорошо выраженной З'-5' экзонуклеазной активностью.
Pfu -полимераза получена из Pyrococcus furiosus. Масса фермента около 92 кДа. Pwo -полимераза отличается сравнительнонизкой процессивностью (эффективно амплифицирует фрагменты до 1 т. п. н.) и обладает 3'-5' экзонуклеазной активностью (proofreading activity). Наличие 3'-5' экзонуклеазной активности делает фермент пригодным для ПЦР, где необходимо получение продукта с высокой точностью синтеза (для последующего клонирования и определения последовательности нуклеотидов).
Слайд 30

Слайд 31

Полимеразная цепная реакция Методы ПЦР Long-PCR протяженная ПЦР Hot-start PCR ПЦР

Полимеразная цепная реакция

Методы ПЦР
Long-PCR протяженная ПЦР
Hot-start PCR ПЦР с горячим стартом
Multiplex-PCR множественная ПЦР
«Nested»-PCR гнездная ПЦР
RAPD-PCR Случайная

амплификация полиморфной ДНК
RT-PCR ПЦР, совмещенная с реакцией обратной
транскрипции (ОТ-ПЦР)
Real time PCR ПЦР в режиме реального времени
Слайд 32

Полимеразная цепная реакция Hot-start PCR (ПЦР c горячим стартом)

Полимеразная цепная реакция

Hot-start PCR (ПЦР c горячим стартом)

Слайд 33

Полимеразная цепная реакция End-point PCR (ПЦР c анализом результатов по конечной точке)

Полимеразная цепная реакция

End-point PCR (ПЦР c анализом результатов по конечной

точке)
Слайд 34

Полимеразная цепная реакция FLASH – Fluorescent Amplification-based Specific Hybridization

Полимеразная цепная реакция

FLASH – Fluorescent Amplification-based Specific Hybridization

Слайд 35

Полимеразная цепная реакция Multiplex-PCR (множественная ПЦР) 45 19 17 44 Прямая

Полимеразная цепная реакция

Multiplex-PCR (множественная ПЦР)

45
19
17
44

Прямая ДНК-диагностика мышечной дистрофии Дюшенна с помощью

мультиплексной ПЦР (электрофорез в агарозном геле). У каждого из обследуемых лиц одновременно амплифицированы четыре экзона гена дистрофина (экзоны 17, 19, 44 и 45; стрелки указывают на соответствующие продукты амплификации).
Слайд 36

Полимеразная цепная реакция «Nested»-PCR (гнездная ПЦР)

Полимеразная цепная реакция

«Nested»-PCR (гнездная ПЦР)

Слайд 37

Полимеразная цепная реакция RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphic DNA - PCR)‏

Полимеразная цепная реакция

RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphic DNA - PCR)‏

Слайд 38

Полимеразная цепная реакция RT-PCR (ОТ-ПЦР) ПЦР, совмещенная с реакцией обратной транскрипции

Полимеразная цепная реакция

RT-PCR (ОТ-ПЦР)
ПЦР, совмещенная с реакцией обратной
транскрипции

Слайд 39

Полимеразная цепная реакция RT-PCR (ОТ-ПЦР) Праймеры для реакции обратной транскрипции

Полимеразная цепная реакция

RT-PCR (ОТ-ПЦР)
Праймеры для реакции обратной транскрипции

Слайд 40

Полимеразная цепная реакция RT-PCR (ОТ-ПЦР)

Полимеразная цепная реакция

RT-PCR (ОТ-ПЦР)

Слайд 41

Полимеразная цепная реакция RT-PCR (ОТ-ПЦР) http://eu.idtdna.com/pages/decoded/decoded-articles/core-concepts/decoded/2011/09/12/ one-step-two-step

Полимеразная цепная реакция

RT-PCR (ОТ-ПЦР)

http://eu.idtdna.com/pages/decoded/decoded-articles/core-concepts/decoded/2011/09/12/
one-step-two-step

Слайд 42

Полимеразная цепная реакция RT-PCR (ОТ-ПЦР) One step RT-PCR

Полимеразная цепная реакция

RT-PCR (ОТ-ПЦР)
One step RT-PCR

Слайд 43

Полимеразная цепная реакция RT-PCR (ОТ-ПЦР) http://eu.idtdna.com/pages/decoded/decoded-articles/core-concepts/decoded/2011/09/12/one-step-two-step

Полимеразная цепная реакция

RT-PCR (ОТ-ПЦР)

http://eu.idtdna.com/pages/decoded/decoded-articles/core-concepts/decoded/2011/09/12/one-step-two-step

Слайд 44

Полимеразная цепная реакция RT-PCR (ОТ-ПЦР)

Полимеразная цепная реакция

RT-PCR (ОТ-ПЦР)

Слайд 45

Полимеразная цепная реакция RT-PCR (ОТ-ПЦР) Детекция РНК-содержащих вирусов

Полимеразная цепная реакция

RT-PCR (ОТ-ПЦР) Детекция РНК-содержащих вирусов

Слайд 46

Полимеразная цепная реакция ПЦР в режиме реального времени неспецифические системы детекции

Полимеразная цепная реакция

ПЦР в режиме реального времени
неспецифические системы детекции
интеркалирующие красители:
SYBR Green

I
SYBR Gold
Слайд 47

Полимеразная цепная реакция ПЦР в режиме реального времени специфические системы детекции линейные разрушаемые зонды (пробы) TaqMan

Полимеразная цепная реакция

ПЦР в режиме реального времени
специфические системы детекции
линейные разрушаемые
зонды

(пробы)
TaqMan
Слайд 48

Праймеры и линейные разрушаемые зонды (пробы) TaqMan

Праймеры и линейные разрушаемые зонды (пробы) TaqMan

Слайд 49

Выбор флуорофора и гасителя

Выбор флуорофора и гасителя

Слайд 50

Полимеразная цепная реакция ПЦР в режиме реального времени специфические системы детекции праймеры- «скорпионы»

Полимеразная цепная реакция

ПЦР в режиме реального времени
специфические системы детекции
праймеры- «скорпионы»

Слайд 51

Полимеразная цепная реакция ПЦР в режиме реального времени специфические системы детекции FRET-PCR

Полимеразная цепная реакция

ПЦР в режиме реального времени
специфические системы детекции FRET-PCR

Слайд 52

Полимеразная цепная реакция ПЦР в режиме реального времени системы детекции

Полимеразная цепная реакция

ПЦР в режиме реального времени
системы детекции

Слайд 53

Слайд 54

Полимеразная цепная реакция ПЦР в режиме реального времени Количественное определение

Полимеразная цепная реакция

ПЦР в режиме реального времени
Количественное определение

Слайд 55

Полимеразная цепная реакция ПЦР в режиме реального времени Количественное определение

Полимеразная цепная реакция

ПЦР в режиме реального времени
Количественное определение

Слайд 56

LB – левая граница Т-ДНК RB – правая граница Т-ДНК P1

LB – левая граница Т-ДНК
RB – правая граница Т-ДНК
P1 – промотор

целевого гена
T1 – терминатор целевого гена
P2 – промотор маркерного гена
T2– терминатор маркерного гена

Структура генетической конструкции, встраиваемой в геном растений

Слайд 57

Структура праймеров и зонда для выявления фрагмента промотора 35S CaMV 22

Структура праймеров и зонда для выявления фрагмента промотора 35S CaMV

22

Структуру и

термодинамические свойства олигонуклеотидов оценивали с помощью программы Real Time Design на сайте http://www.biosearchtech.com/.

Праймер 35Sf - CCACTGACGTAAGGGATGAC, длина 20 н., Tm – 64,2 °С
Праймер 53Sr – CTCTCCAAATGAAATGAACTTCC, длина 23 н. Tm – 63,1 °С
Зонд – FAM- CAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCC-BHQ1, длина – 26 н.,Tm – 70,5 °С

Слайд 58

Режим ПЦР * - регистрация результатов

Режим ПЦР

* - регистрация результатов

Слайд 59

Изменение флуоресценции в реакционной смеси в ходе полимеразной цепной реакции Флуоресценция

Изменение флуоресценции в реакционной смеси в ходе полимеразной цепной реакции

Флуоресценция красителя

FAM, связанного с зондом на целевой фрагмент ДНК

Флуоресценция красителя HEX, связанного с зондом на референсный фрагмент ДНК (внутренний контроль)

Слайд 60

Протокол реакции Примечание: Cp – номер порогового цикла

Протокол реакции

Примечание: Cp – номер порогового цикла

Слайд 61

Электрофореграмма фрагментов ДНК, полученных после ПЦР с использованием праймеров коммерческой тест-системы,

Электрофореграмма фрагментов ДНК, полученных
после ПЦР с использованием праймеров коммерческой тест-системы,

специфичных к Р-35S

1- ДНК-маркеры; 2- положительный контроль; 3-9 – продукты амплификации целевого фрагмента (~200 п.н.) и референсного гена (~600 п.н.) в образцах №1-7. Электрофорез проводили в 1% агарозном геле.

Слайд 62

Модификация концов копируемого фрагмента

Модификация концов копируемого фрагмента

Слайд 63

Подбор вырожденных праймеров

Подбор вырожденных праймеров

Слайд 64

ПЦР-биочипы

ПЦР-биочипы

Слайд 65

Проточные ПЦР-биочипы

Проточные ПЦР-биочипы

- Предыдущая
Воинские звания и знаки различия РККА 1940 - 1943
Следующая -
Tiesību pamati

Похожие презентации

Кольчатые черви. Дождевой червь
Чарльз Дарвін
Презентация на тему Разнообразие растений
Презентация по биологии Класс Птицы Ученицы 7в класса Грицаенко Елизаветы
Презентация на тему Теория панспермии- жизнь на нашу планету занесена извне, из Вселенной.
Взаимосвязь между структурой, свойствами и функциями клеточной мембраны
Общая характеристика класса Птицы. Особенности внешнего строения птиц. Скелет
Скелетные мышцы и их строение
Эколого-анатомические особенности покрытосеменных растений верхового болота
Тема : Что такое биология?
Молекулярные механизмы наследственности
Лето и здоровье человека. Правила поведения у водоемов и на воде. Летнее закаливание организма (человек и мир, 1 класс)
Презентация на тему "Морфология листа" - скачать презентации по Биологии
Міні - проект опале листя: користь чи шкода
Все о породах кошек
Микробиология на службе человека
Жизненные формы растений
Надзвичайний світ амфібій
Растениеводство. Общая характеристика зерновых культур
Пищеварительная система человека: строение, значение, функции
Оболочки Земли Подготовила учитель биологии МАОУ «СОШ № 13» Великого Новгорода Мариничева Л.Г
Подготовила: С.Н. Косырькова, учитель экологии МБОУ «Озёрная СОШ»
Особенности питания растений
Тип кишечнополостные Вводная характеристика кишечнополостных. Класс Гидроидные
Вплив на безпеку та життя людей та їх майбутніх поколінь ГМО, ферментів та гормонів. Анастасія Ткаченко
Класс Ракообразных. Представитель: Дафния Выполнила: Колбун Виолетта 8 «А» класс
Углеводы
Rosengewächse (Pfirsich)
Вы можете прислать нам Вашу презентацию и мы опубликуем ее на сайте.
Обратная связь
Для правообладателей
Email: Нажмите что бы посмотреть