ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ ТРАНСГЕНЕЗ. МИКРООРГАНИЗМЫ Лекция 5

Перспективы развития генетической инженерии

РЕКОМБИНАЦИЯ

ТРАНСГЕНЕЗ. МИКРООРГАНИЗМЫ. Лекция 5

Рекомбинация – процесс реорганизации генома, обмен участками ДНК

Словарь

Виды рекомбинационных событий

Классификация рекомбинационных явлений

Схема сайт-специфической рекомбинации
бактериофага лямбда

А) линейная (вирионная) ДНК фага
Б) ДНК

РЕКОМБИНОГЕНЕЗ

ТРАНСГЕНЕЗ. МИКРООРГАНИЗМЫ. Лекция 5

позволяет кардинально изменять живые организмы на генетическом уровне, вплоть до создания

Открытие явления трансформации

1928 г.
открытие явления трансформации

Фредерик Гриффит

Streptococcus pneumoniae – пневмококки.

Метод создания новых генетических программ путем конструирования и внесения новой генетической

Berg, Paul (США)
(р. 1926) Нобелевская премия по химии, 1980

1972 г. Анни Чанг
Герберт Бойер
Поль Берг
Стенли

ОСНОВНЫЕ ТИПЫ ФЕРМЕНТОВ

ТРАНСГЕНЕЗ. МИКРООРГАНИЗМЫ. Лекция 5

«Генетическая инженерия – потомок молекулярной генетики, но своим рождением обязана успехам

Суть метода

Рекомбинантная ДНК – искусственно сконструированная ДНК, несущая фрагменты генетической информации разных

I этап Получение гена

II этап Создание рекомбинантной ДНК

III этап Создание трансгенного

I ЭТАП. ПОЛУЧЕНИЕ ГЕНА

ТРАНСГЕНЕЗ. МИКРООРГАНИЗМЫ. Лекция 5

I этап Получение гена

Цель:
получение гена-матрицы для молекулярного клонирования

Методы:
1) рестриктазный
2)

Рестриктазы – ферменты, узнающие особые последовательности нуклеотидов в ДНК (сайты рестрикции)

Рестриктазы.
Типы рестрикции.

Химико-ферментативный синтез гена

Разработан X. Кораной
хим. синтез комплементарных, взаимоперекрывающихся олигонуклеотидов
соединение

ДНК

экзон

интрон

экзон

экзон

интрон

Транскрипция

РНК первичный транскрипт

Сплайсинг

Матричная РНК

Обратная транскрипция

Клональная ДНК

Синтез на основе mРНК

II ЭТАП. ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК

ТРАНСГЕНЕЗ. МИКРООРГАНИЗМЫ. Лекция 5

I этап Получение гена

II этап Создание рекомбинантной ДНК

Цель:
внесение гена-матрицы (трансгена)

ВЕКТОРА (лат. vector – несущий)

молекулы способные к самостоятельной репликации

Словарь

Амплификация – увеличение количества копий rДНК (трансген + вектор)
Интеграция –

Требования к векторным молекулам

Классификация векторов
по реципиентным системам

Естественные
плазмиды
бактериофаги

Искусственные космиды
фазмиды
бакмиды

Естественные
плазмиды
вирусы

Искусственные челночные векторы

Вектора прокариот

Вектора

Словарь

Бакмиды – челночные векторы на основе генома бакуловируса, способные существовать в

http://rudocs.exdat.com

Классификация векторов
по функциям

Клонирующие

вектора, обеспечивающие репликацию гибридной молекулы в клетке

Экспрессирующие

I этап Получение гена

II этап Создание рекомбинантной ДНК

Методы введения гена в

Применим для гена и вектора с комплементарными «липкими» концами

Рестриктазо-лигазный метод

Впервые был применен С. Коэном в 1973 году.
Рестриктазы, вносят в

http://zhurnal.lib.ru/

Применим для гена и вектора с некомплементарными «тупыми» концами

Коннекторный метод

Впервые

III ЭТАП. СОЗДАНИЕ ТРАНСГЕННОГО ОРГАНИЗМА

ТРАНСГЕНЕЗ. МИКРООРГАНИЗМЫ. Лекция 5

I этап Получение гена

II этап Создание рекомбинантной ДНК

III этап Создание трансгенного

Естественные

Конъюгация

Трансдукция

Трансфекция

Искусственные

Трансформация

Методы введения рДНК в
клетку-реципиент

Методы введения rДНК в клетку-реципиент трансдукция
(вектор с элементами генома бактериофага)

http://sd1.uchebalegko.ru

Методы введения rДНК в клетку-реципиент трансфекция
(вектор с элементами генома вируса)

Методы введения rДНК в клетку-реципиент коньюгация
(вектор с элементами генома плазмид)

Методы введения rДНК в клетку-реципиент трансформация
(при физиологической некомпетентности)

микроиньекция

электропорация

липофекция

биобаллистика

http://rudocs.exdat.com

IV ЭТАП. ОТБОР

ТРАНСГЕНЕЗ. МИКРООРГАНИЗМЫ. Лекция 5

I этап Получение гена

II этап Создание рекомбинантной ДНК

III этап Создание трансгенного

1. Отбор клеток, несущих вектор

2. Отбор клеток, несущих ген-мишень

Методы отбора

а) Применение репортерных (маркерных) генов первого, второго и третьего поколений:

верхнем правом углу много мелких названий – это перечислены сайты рестрикции

Отбор по векторам
Устойчивость к антибиотику

Отбор по векторам.
GFP

Отбор по трансгену
блот-анализа по Саузерену

1. Синтезируют меченые нуклеотиды (ДНК зонды)
2.

Первые достижения