ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ ТРАНСГЕНЕЗ. РАСТЕНИЯ Лекция 6

Словарь

Экспрессия гена – появление в клетках организма-реципиента биологически активного генного продукта
Кассета

Причины внедрения в практику генетической инженерии
растений

ТЕХНИКА ТРАНСГЕНЕЗА

ТРАНСГЕНЕЗ РАСТЕНИЯ. Лекция 6

Этапы получения трансгенных растений
(до принятия решения
об интродукции)

ЭТАП 1. ПОЛУЧЕНИЕ И АМПЛИФИКАЦИЯ RДНК (КАССЕТА ЭКСПРЕССИИ+ВЕКТОР)

ТРАНСГЕНЕЗ РАСТЕНИЯ. Лекция 6

Кассета экспрессии

Промотор + целевой ген (трансген) + терминатор

Промоторы для кассеты экспрессии.
Классификация

КОНСТИТУТИВНЫЕ

СПЕЦИФИЧНЫЕ

Обеспечивают экспрессию на протяжении всего срока жизни трансгенного

Векторы для переноса и интеграции кассеты экспрессии. Основа

АГРОБАКТЕРИАЛЬНАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ. TI- И RI-ПЛАЗМИДЫ

ЭТАП 1.

http://commons.wikimedia.org

1980 г. М. Ван Монтегю и Д. Шелл
открыли явление агробактеральной

Ti-плазмиды tumor-inducing, опухолеобразующие поражают наземную часть растений

найдены в Agrobacterium tumefaciens – вызывающие

Ri-плазмиды root-inducing, вызывают образование «бородатого» корня, поражают ризосферу

найдены в Agrobacterium rhizogenes способны

Механизм действия агробактерий

При повреждении клетки растения в почву попадают продукты обмена

Механизм действия агробактерий

В геноме растения Т-ДНК запускает синтез ферментов, необходимых для

Ti-плазмиды. Структура.

Размер от 200 т.п.н. до 800 т.п.н
Основные элементы:
Оri-область
Vir-область
Область Т-ДНК

Ауксины
(индол-3-уксусная

Ti-плазмиды. Механизм действия

Ti-плазмиды. Вырезание Т-ДНК.

Перенос Т-ДНК в растительный геном

http://www.nature.com

Т-ДНК встраиваются в разные, по-видимому случайные, точки

Модификация Ti-плазмид для трансгенеза. Неонкогенная Ti-плазмида

удаляется область Т-ДНК
добавляется сайт инициации репликации

Векторы для генетической трансформации растительных геномов. Бинарные векторы.

БИНАРНЫЕ

Содержат 2 сайта оri

Векторы для генетической трансформации растительных геномов. Коинтегративные

КОИНТЕГРАТИВНЫЕ

Содержат ori Е. coli, Т-ДНК,

Векторы для генетической трансформации растительных геномов. Коинтегративные

http://www.sciencedirect.com

Использование агробактерий в трансгенезе растений

недостаток системы агробактерий – это неспособ­ность трансформировать

ОПОСРЕДОВАННЫЙ ДНК ПЕРЕНОС ГЕНОВ. DMGT- ВЕКТОРЫ

ЭТАП 1.

DMGT-векторы
(DNA-mediated gene transfer)

DMGT-векторы
(DNA-mediated gene transfer)

Вектор pBin 19 (11777 п.н.)

M13 R primer: AGG AAA CAG

ЭТАП 2. ВЫБОР И ПОДГОТОВКА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК-РЕЦИПИЕНТОВ ДЛЯ ТРАНСГЕНЕЗА

ТРАНСГЕНЕЗ РАСТЕНИЯ. Лекция

Словарь

Тотипотентность – свойство клеток реализовать генетическую информацию ядра, обеспечивающую их

При трансформации растений трансген может быть
внесен:

в целые растений
в клетки каллусной

ЭТАП 3. ВСТРАИВАНИЕ ТРАНСГЕНА В ГЕНОМ РАСТЕНИЯ (В КЛЕТКУ-РЕЦИПИЕНТ)

ТРАНСГЕНЕЗ РАСТЕНИЯ. Лекция

Способы внесения трансгена в клетки растений

Прямые методы

Опосредованные методы

Электропорация
Микроинъекция
Биобалистика
Со-культивировние
Инокуляция

При помощи векторов:
Ti-плазмиды
Ri-плазмиды
Вирусы

ЭЛЕКТРОПОРАЦИЯ - клеточные мембраны, становиться проницаемой для экзогенных молекул ДНК под

БИОБАЛИСТИКА Общий вид и схема установки для биобаллистической доставки генов в

via Agrobacterium

Перенос трансгенов в растения

Целое
растение

Инфильтрация

Культивируемые in vitro
клетки, компетентные к
регенерации

Инфильтрация
микроинъекция
со-культивирование

Прямой

ЭТАП 4. ОТБОР ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КЛЕТОК, РАСТЕНИЙ

ТРАНСГЕНЕЗ РАСТЕНИЯ. Лекция 6

Ti-плазмиды. Механизм действия

Alternative selection system based on the phosphomannose isomerase gene

Протокол трансформации пшеницы: сочетание селекции на фосфинотрицине (РРТ) с визуальной селекцией

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ

ТРАНСГЕНЕЗ РАСТЕНИЯ. Лекция 6

Предмет биотехнологии растений

Генетическая трансформация растений – позволяет создавать растения:
а)

контроль трансгенное

Устойчивость трансгенного табака с геном bt к личинкам непарного шелкопряда

контроль клон 2 клон 1