БИОТЕХНОЛОГИЯ Гормональных препаратов

Сентябрь 3, 2022

Главная
Алгебра
БИОТЕХНОЛОГИЯ Гормональных препаратов

Содержание

4. Всего в организме вырабатывается более 100 гормонов и каждый из них играет очень важную роль в
6. ЛИПОФИЛЬНЫЕ ГОРМОНЫ КЛЕТКИ
7. ГИДРОФИЛЬНЫЕ ГОРМОНЫ
8. и н с у л и н 1. Увеличивает проницаемость плазматических мембран клеток для глюкозы, 2.
9. Ферменты гликолиза: 1 — Гексокиназа 2 — Глюкозо-6-фосфатизомераза 3 — 6-Фосфофруктокиназа 4 — Альдолаза 5 —
10. Инсулин вырабатывается в бета-клетках островков Лангерганса поджелудочной железы. 70% матричной РНК, выделенной из этих клеток, кодируют
11. ПОСЛЕДСТВИЯ ДЕФИЦИТА ИНСУЛИНА
12. Человеческий инсулин Инсулин это полипептид с м.м. 5808; - 51 аминокислота - 2 полипептидные цепи, соединенные
13. как происходит биосинтез инсулина в организме, в β-клетках островков Лангерганса
14. СИНТЕЗ ИНСУЛИНА В КЛЕТКАХ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
15. 1 - синтез полипептидной цепи препроинсулина; 2 - синтез происходит на полирибосомах, прикрепленных к наружной поверхности
16. Биосинтез инсулина в β-клетках островков Лангерганса L-пептид β-пептид C-пептид ɑ-пептид 20 аминокислот 33 аминокислоты эндопептидаза эндопептидаза
17. МОНОМЕРЫ инсулина Структура кристалла инсулина, депонируемого в β-клетках островков ЛАНГЕРГАНСА. Image of six insulin molecules assembled
18. БИОСИНТЕЗ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ИНСУЛИНА Ι. Замещение 1 аминокислоты в молекуле свиного инсулина ΙΙ. Синтез ɑ- и β-цепей
19. Преобразование инсулина свиней в инсулин человека (ала – у свиней) Моноинсулин Ферментативное замещение 30-й аминокислоты в
20. Микробиологический синтез инсулина: Химическим путем создают синтетический ген проинсулина. На N-конце гена - кодон ТAС (метионин),
21. Очистка синтетического инсулина Важно очистить инсулин проинсулина, который индуцируют выработку антиинсулиновых антител. Используется хроматографическая очистка: Ионообменная,
22. Стандартизация инсулина По чистоте классифицируют препараты инсулина на 4 группы, в зависимости от содержания проинсулина: обычные,
24. Соматотропный гормон
25. Обратитмся к литературе. И на сей раз к приключенческой. Но вовсе не замысловатый сюжет повести Еремея
26. «Открытие» соматотропина произошло задолго до XX столетия. Правда, врачи и алхимики средневековья не предполагали, какое именно
27. Ну зачем же так категорично ставить вопрос, возможно, поправит меня читатель, ведь никто не запрещает специалистам
28. Рукотворный синтезатор белков (метод Меррифилда — твердофазного синтеза белков. Вспомните, ученый «пришивал» к поверхности твердого носителя
29. Структура гормона передней доли гипофиза (СТГ),
30. СОМАТОТРОПНЫЙ ГОРМОН (СТГ) Состоит из 191 амк. Регулирует рост человека, применяется и для лечения ожогов, переломов,
31. Схема экспрессии чужеродных генов довольно проста, но на практике возникают следующие проблемы. Регуляторные сигналы эукариот сильно
32. Получение гонадотропного гормона в клетках Е. Coli разработано К. Итакурой и Г. Бойером. Аминокислотная последовательность этого
33. Получение гонадотропного гормона соматостатина через гибридный белок - бета-галактозидазу В образующемся химерном белке соматостатин отделен от
34. Эритропоэтин
35. Структура молекулы эритропоэтина (схема)
37. Скачать презентацию

Слайд 2

Слайд 3

Слайд 4

Всего в организме вырабатывается более 100 гормонов и каждый из них

играет очень важную роль в регулировании функций тех или иных органов

Слайд 5

Слайд 6

ЛИПОФИЛЬНЫЕ
ГОРМОНЫ
КЛЕТКИ

Слайд 7

ГИДРОФИЛЬНЫЕ ГОРМОНЫ

Слайд 8

и н с у л и н
1. Увеличивает проницаемость плазматических мембран

клеток для глюкозы,
2. Активирует ферменты гликолиза (см. след. рис.)
3. Стимулирует образование в печени и мышцах из глюкозы гликогена,
4. Подавляет активность ферментов, расщепляющих гликоген и жиры
5. Усиливает синтез жиров и белков.

Слайд 9

Ферменты гликолиза: 1 — Гексокиназа 2 — Глюкозо-6-фосфатизомераза 3 — 6-Фосфофруктокиназа

4 — Альдолаза 5 — Триозофосфатизомераза 6 — Глицеральдегидфосфатдегидрогеназа 7 — Фосфоглицераткиназа 8 — Фосфоглицеромутаза 9 — Eнолаза 10 — Пируваткиназа

Слайд 10

Инсулин вырабатывается в бета-клетках островков Лангерганса поджелудочной железы.
70% матричной РНК,

выделенной из этих клеток, кодируют именно инсулин.
Инсулин секретируется в ответ на стимуляторы секреции инсулина (глюкозу, маннозу, аминокислоты – лейцин, аргинин). Человеческая поджелудочная железа содержит до 8 мг инсулина (200 биол. Ед; 1 мг = 28 БЕ).

Слайд 11

ПОСЛЕДСТВИЯ ДЕФИЦИТА ИНСУЛИНА

Слайд 12

Человеческий инсулин
Инсулин это полипептид с м.м. 5808;
- 51 аминокислота
-

2 полипептидные цепи, соединенные дисульфидными мостиками:
цепь А - 21 аминокислота
цепь Б – 30 аминокислот
Аминокислотный состав цепей видоспецифичен

Структура инсулина расшифрована в 1954 г. англ. биохимиком
Ф. Сенджером

Слайд 13

как происходит биосинтез инсулина в организме, в β-клетках островков Лангерганса

Слайд 14

СИНТЕЗ ИНСУЛИНА В КЛЕТКАХ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Слайд 15

1 - синтез полипептидной цепи препроинсулина;
2 - синтез происходит на

полирибосомах, прикрепленных к наружной поверхности мембраны эндоплазматического ретикулюма (ЭР);
3 - сигнальный пептид отщепляется по завершении синтеза полипептидной цепи и образуется проинсулин;
4 - проинсулин транспортируется из ЭР в аппарат Гольджи и расщепляется на инсулин и С-пептид;
5 - Молекулы инсулина, соединяются с ионами цинка и образуют кристаллические гексамерные агрегаты. Кристаллы инсулина включаются в секреторные гранулы и депонируются,
6 – зрелые гранулы постепенно выделяются путем экзоцитоза (6);

Биосинтез инсулина в β-клетках островков Лангерганса

ядро

мРНК

Слайд 16

Биосинтез инсулина в β-клетках островков Лангерганса
L-пептид
β-пептид
C-пептид
ɑ-пептид
20 аминокислот
33 аминокислоты
эндопептидаза
эндопептидаза

Слайд 17

МОНОМЕРЫ инсулина
Структура кристалла инсулина, депонируемого в β-клетках островков ЛАНГЕРГАНСА.
Image of

six insulin molecules assembled in a hexamer, highlighting the threefold symmetry, the zinc ions holding it together, and the histidine residues involved in zinc binding. Insulin is stored in the body as a hexamer, while the active form is the monomer.

+ 2 Zn2+

После экзоцитоза кристаллы инсулина, попадают в межклеточное пространство и кровоток. Изменение физических свойств среды приводит к отщеплению цинка и распаду кристаллического неактивного инсулина на отдельные молекулы, которые и обладают биологической активностью.

Биологически активные
молекулы инсулина

Слайд 18

БИОСИНТЕЗ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ИНСУЛИНА
Ι. Замещение 1 аминокислоты в молекуле свиного инсулина
ΙΙ. Синтез

ɑ- и β-цепей инсулина в клетках E. Coli с последующим соединением их в молекулу гормона (Великобритания)
ΙΙΙ. Синтез проинсулина в клетках E. Coli с последующим преобразованием в инсулин (РАН ИБОХ)

Слайд 19

Преобразование инсулина свиней в инсулин человека
(ала – у свиней)
Моноинсулин
Ферментативное

замещение 30-й аминокислоты в цепи В (у свиней – это аланин) на треонин (у человека) и последующая хроматографическая очистка

Метод разработан в 1980г. датской фармкомпанией «Novo»

Слайд 20

Микробиологический синтез инсулина:
Химическим путем создают синтетический ген проинсулина. На N-конце

гена - кодон ТAС (метионин), а на С-конце - два стоп-кодона (терминатор).
Ген присоединяют к фрагменту гена β-галактозидазы Е. coli в С-кон-цевой части. Образующийся гибридный ген имеет свой промотор и свой рибо-сом-связывающий участок
Встраивают в плазмиду ВpR322 с помощью ДНК-лигазы
Гибридный ген трансформируют в клетку-хозяина
Выделяют и культивируют транс-формированные клетки
Проинсулин, в составе β-галакто-зидазного гибридного белка выделяют и подвергают химико-ферментативной трансформации в той же последователь-ности, что и in vivo:
отщепляют β-галактозидазный фрагмент,
проводят окислительный сульфитолиз с последующим восстановительным замыканием 3-х дисульфидных связей
Ферментативно (эндопептидаза) вычленяют связывающий центральный пептид C.

Слайд 21

Очистка синтетического инсулина
Важно очистить инсулин проинсулина, который индуцируют выработку антиинсулиновых антител.

Используется хроматографическая очистка:
Ионообменная,
Гелевая
ВЭЖХ.
Наиболее эффективна аффинная хроматография

Слайд 22

Стандартизация инсулина
По чистоте классифицируют препараты инсулина на 4 группы, в зависимости

от содержания проинсулина:
обычные, содержат проинсулин более 1%
монопиковые – менее 0,3% (Гельфильтрационная хроматография)
улучшенные монопиковые – менее 0,005%
монокомпонентные – менее 0,001%
Полный контроль производства генноинженерного инсулина включает:
контроль стабильности рекомбинантного штамма и плазмиды,
отсутствие постороннего генетического материала в препарате,
идентичность экспрессируемого гена
и т.д., всего 22 показателя.

Слайд 23

Слайд 24

Соматотропный гормон

Слайд 25

Обратитмся к литературе. И на сей раз к приключенческой. Но вовсе

не замысловатый сюжет повести Еремея Парнова «Ларец Марии Медичи» привлек наше внимание к ней. Дело здесь в ином, во вполне банальной жизненной ситуации, в которой по воле автора оказываются главные герои. Их, как и положено, двое — он и она, Вера Фабиановна и Лев Минеевич. Она — высокая, властная и по сей день замечательно красивая старуха, он — маленький, пухленький старичок с детскими ручонками. И тот и другой не раз и не два задумывались на склоне лет, почему же, собственно, так и не соединились их судьбы?
А виной тому была так, безделица, совсем пустячок — маленький рост Льва Минеевича. Стоит ли дальше рассуждать по этому поводу? Или и так всем все понятно?

Между тем беде Льва Минеевича, появись он на свет лет эдак на 65 попозже, вполне можно было б помочь. По крайней мере, искусственно синтезируемый соматотропин (гормон роста), продуцируемый в организме гипофизом, важнейшей железой эндокринной системы, сегодня — реально существующий препарат. И, как очевидно из вышеприведенной информации, производство его весьма доходное, а сам он — предмет коммерции многих фирм, занимающихся сбытом биотехнологической продукции.

Слайд 26

«Открытие» соматотропина произошло задолго до XX столетия. Правда, врачи и алхимики

средневековья не предполагали, какое именно активное начало содержится в экстракте, приготовленном из железы, что расположена у самого основания черепа. Но зато они знали, как из него сделать экстракт и как с его помощью вырастить чудовищно гигантских крыс.
Экспериментировали с гипофизом и в XIX столетии, а в XX веке гипофизы умерших или погибших по разным причинам людей стали для медиков и фармакологов единственным источником соматотропина, с помощью которого они возвращали нуждающимся в помощи детям, в некотором смысле обделенным природой, высокий рост. А вместе с ним — красоту и уверенность в себе.
Но курс лечения долог и эффективен только при наличии нужных количеств дефицитного гормона. Под словами «нужных количеств» здесь имеются в виду вполне конкретные цифры: полный курс лечения, обеспечивающий мальчику или девочке нормальное развитие, предполагает такое количество соматотропина, которое в состоянии наработать 100—150 человеческих гипофизов. А где их столько взять?

Слайд 27

Ну зачем же так категорично ставить вопрос, возможно, поправит меня читатель,

ведь никто не запрещает специалистам воспользоваться гипофизами животного происхождения, они ведь тоже продуцируют соматотропин.
В том-то и дело, что человеку нужен только человеческий гормон роста. Препарат животного происхождения (точнее, выделенный из гипофиза крупного рогатого скота) ему не подходит, поскольку гормон роста — видоспецифический.
Правда, как и во всяком правиле, здесь тоже есть исключение. Крыса, например, на соматотропин любого происхождения реагирует как на свой собственный, столь пластична и легко приспособляема ее природа.
Но человек — не крыса; его «любой» гормон не устраивает. Значит, уповать приходится только на чужую беду. Вот почему до недавнего времени все производство натурального соматотропина основывалось на экстрактах, приготовленных из трупных гипофизов.

Слайд 28

Рукотворный синтезатор белков (метод Меррифилда — твердофазного синтеза белков. Вспомните, ученый

«пришивал» к поверхности твердого носителя собираемые в определенной последовательности аминокислоты полипептидов) пока не идет ни в какое сравнение с естественным, природным синтезатором — живой клеткой, в котором белки производятся по аналогичной схеме, а вот ошибки исключаются вовсе. Ведь в клетке без устали трудится, не зная ни смен, ни вахт, собственное ОТК — самоконтроль.
Вот почему по точности и эффективности с клеточным производством не может сравниться ничто на свете — в ней молекула управляет молекулой.

Слайд 29

Структура гормона передней доли гипофиза (СТГ),

Слайд 30

СОМАТОТРОПНЫЙ ГОРМОН (СТГ)
Состоит из 191 амк. Регулирует рост человека, применяется и

для лечения ожогов, переломов, язв.
1963 – получали из трупного материала, всего 4-6 мг соматотропина из 1 трупа. Этого количества катастрофически не хватало.
Кроме того были частыми явления заражения гипофизарного материала нейротоксическим вирусом с очень длительным инкубационным периодом. Этот вирус нередко приводил к летальному исходу реципиентов гормона трупного происхождения. В 1985 г. ВОЗ запретила применение СТГ, выделяемого из трупных человеческих гипофизов.
В 1980 г. фирмой «Genentech» получен рекомбинантный СТГ – соматрем. Отличается более высокой активностью от искусственно получаемого гипофизарного ввиду более высокой степени очистки.

Слайд 31

Схема экспрессии чужеродных генов довольно проста, но на практике возникают следующие

проблемы.
Регуляторные сигналы эукариот сильно отличаются от регуляторных сигналов бактерий и не узнаются бактериальными РНК-полимеразами и рибосомами. При клонировании в бактериях ДНК эукариотической клетки экспрессия не происходит, поскольку в бактериальной клетке отсутствует система "сплайсинга".
Поэтому для осуществления экспрессии эукариотического гена соответствующая кДНК присоединяется в составе векторной молекулы к регуляторным элементам бактерии - промотору и рибосом-связывающему участку.
Присоединение ведется таким образом, что кодирующая часть эукариотического гена присоединяется к кодирующей части бактериального гена так, чтобы сохранялась "рамка" считывания. В этом случае образуются гибридные белки, содержащие в N-концевой части бактериальный белок или его часть, а в С-концевой части - эукариотический белок. Примером использования такого способа экспрессии является получение гонадотропного гормона соматостатина в клетках Е. Coli

Слайд 32

Получение гонадотропного гормона в клетках Е. Coli разработано К. Итакурой и

Г. Бойером.
Аминокислотная последовательность этого гормона была известна биотехнологам, и исходя из нее, согласно генетическому коду, была выведена структура соответствующего искусственного гена.
После этого был осуществлен его синтез: ген содержал на N-конце кодон АТС, кодирующий метионин, и липкий конец, соответствующий расщеплению рестриктазой EcoRI - AATT, а на С-конце - два стоп-кодона.
Этот фрагмент ДНК был присоединен к фрагменту гена бета-галактозидазы Е. coli, содержащему в С-концевой части участок расщепления EcoRI, и вместе со своим промотором и оператором был встроен в плазмиду pBR322. В результате такого соединения получен гибридный ген, в котором С-концевая часть гена бета-галактозидазы заменена "геном" соматостатина. Между геном бета-галактозидазы и собственно геном соматостатина находится кодон метионина.

Слайд 33

Получение гонадотропного гормона соматостатина через гибридный белок - бета-галактозидазу
В образующемся химерном

белке соматостатин отделен от галактозидазной части остатком метионина.
Поскольку соматостатин (ЛВ) не содержит метиониновых остатков, то химерный белок расщепляют бромцианом и отделяют соматостатин в виде целого пептида

Слайд 34

Эритропоэтин

Слайд 35

БИОТЕХНОЛОГИЯ Гормональных препаратов

Содержание

Всего в организме вырабатывается более 100 гормонов и каждый из них

ЛИПОФИЛЬНЫЕ ГОРМОНЫКЛЕТКИ

ГИДРОФИЛЬНЫЕ ГОРМОНЫ

и н с у л и н1. Увеличивает проницаемость плазматических мембран

Ферменты гликолиза: 1 — Гексокиназа 2 — Глюкозо-6-фосфатизомераза 3 — 6-Фосфофруктокиназа

Инсулин вырабатывается в бета-клетках островков Лангерганса поджелудочной железы. 70% матричной РНК,

ПОСЛЕДСТВИЯ ДЕФИЦИТА ИНСУЛИНА

Человеческий инсулинИнсулин это полипептид с м.м. 5808; - 51 аминокислота -

как происходит биосинтез инсулина в организме, в β-клетках островков Лангерганса

СИНТЕЗ ИНСУЛИНА В КЛЕТКАХ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

1 - синтез полипептидной цепи препроинсулина; 2 - синтез происходит на

Биосинтез инсулина в β-клетках островков Лангерганса L-пептидβ-пептидC-пептидɑ-пептид20 аминокислот33 аминокислотыэндопептидазаэндопептидаза

МОНОМЕРЫ инсулинаСтруктура кристалла инсулина, депонируемого в β-клетках островков ЛАНГЕРГАНСА. Image of

БИОСИНТЕЗ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ИНСУЛИНА Ι. Замещение 1 аминокислоты в молекуле свиного инсулинаΙΙ. Синтез

Преобразование инсулина свиней в инсулин человека (ала – у свиней)Моноинсулин Ферментативное

Микробиологический синтез инсулина: Химическим путем создают синтетический ген проинсулина. На N-конце

Очистка синтетического инсулинаВажно очистить инсулин проинсулина, который индуцируют выработку антиинсулиновых антител.

Стандартизация инсулинаПо чистоте классифицируют препараты инсулина на 4 группы, в зависимости