Титульный лист

культивирования и определить характеристики, по которым ЭСК с выявленными хромосомными перестройками отличаются от клеток исходных линий.

Слайд 2 из 17

– hESM01, hESM02, hESM03 и hESM04 – в процессе культивирования;
2) провести молекулярно-цитогенетический анализ состава и организации выявленных перестроенных хромосом;
3) получить и охарактеризовать дифференцированные клетки из ЭСК с нормальным кариотипом, а также из ЭСК, несущих выявленные аномальные хромосомы;
4) провести сравнительный анализ характеристик ЭСК исходных линий hESM01-04 и ЭСК, несущих аномальные хромосомы;
5) разработать метод одновременной визуализации и идентификации хромосомных территорий перестроенной хромосомы и её нормального гомолога в трёхмерном пространстве интерфазного ядра ЭСК, несущих выявленные аномальные хромосомы;
6)провести оценку влияния хромосомных перестроек на положение хромосом в интерфазных ядрах ЭСК, несущих выявленные аномальные хромосомы.

Слайд 3 из 17

с помощью антител против CD105 (a), пролил-гидроксилазы (б);
ядра окрашены DAPI – синий цвет.

а б

Общий вид клеток

Слайд 4 из 17

клеток hESM01r18.
На фотографиях «а» и «б»
представлены фрагменты колоний.
а – Tra-1-60 – красный сигнал, ядра окрашены DAPI – синий цвет;
б – OCT4 – зелёный сигнал.

Сублиния hESM01r18. 46, ХХ, r(18)

del(4)

4

микродиссекционной
ДНК пробы der(18) с хромосомами клеток сублинии hESM01r18

FISH теломерной
ДНК пробы с хромосомами
клеток сублинии ESM01r18

der(18)

der(18)

Реорганизация хромосомы 18 в клетках сублинии ESM01r18

Слайд 6 из 17

der(18) c метафазными хромосомами лимфоцитов взрослого человека с нормальным кариотипом

18(p11.31q21.2)

Реорганизация хромосомы 18 в клетках сублинии ESM01r18

Слайд 7 из 17

ДНК пробы der(18) с хромосомами
клеток сублинии hESM01r18

Реорганизация хромосомы 18 в клетках сублинии hESM01r18

Слайд 8 из 17

hESM03der9;
б - с хромосомами лимфоцитов здорового донора (фрагмент пластинки).

der(9)

9

del(4)

4

del(4)(q25q31.1)

и der(9) для получения хромосомоспецифичных проб WCP9 и WCPder(9), а также районоспецифичных проб PCPder(9)-p, PCPder(9)-1, PCPder(9)-2 и центромерной пробы PCPC

Схема микродиссекции хромосом 9 и её деривата

Слайд 10 из 17

и прицентромерной PCP9C (жёлтый цвет) микродиссекционных ДНК проб с хромосомами клеток сублинии hESM03der9.

Пример гибридизации микродисс проб из материала хромосом 9 и её деривата на дериватные хромосомы

Слайд 11 из 17

клонированного фрагмента ДНК из района делеции.

Оптические срезы двух ядер (три проекции).

Совместная 3D FISH ДНК пробы, маркирующей нормальный гомолог хромосомы 18, и хромосомоспецифичной пробы WCP18, окрашивающей хромосомные территории хромосомы 18 и её деривата. Ядра окрашены DAPI – синий цвет.

Визуализация и идентификация хромосомных территорий хромосомы 18 и её деривата

hESM01r18

Совместная 3D FISH ДНК пробы, маркирующей нормальный гомолог хромосомы 18, и хромосомоспецифичной пробы WCP18, окрашивающей хромосомные территории хромосомы 18 и её деривата. Ядра окрашены DAPI – синий цвет.

Серии оптических срезов.

Трёхмерная реконструкция хромосомных территорий хромосом 18 и r18 в ядрах клеток hESM01r18

клетки сублинии hESM03der9

3D FISH хромосомоспецифичной WCPder(9) (зелёный цвет) и прицентромерной PCP9C (красный цвет) ДНК проб с ядрами ESM03der9.

der(9)

9

3D реконструкция хромосомы 9 и её деривата в пространстве интерфазного ядра клетки сублинии hESM03der9

время показано, что при проведении регулярного
мониторинга состояния кариотипа возможно проведение длительного
культивирования клеток hESM01-04, не сопровождающееся тотальной
дестабилизацией кариотипа.
Детально охарактеризованы выявленные аномальные хромосомы, являвшиеся производными хромосом 4, 9 и 18, с помощью полученного комплекта микродиссекционных проб.
3) Показано, что, несмотря на сохранение «маркёров плюрипотентности», способности к дифференцировке ЭСК, отягощённых выявленными хромосомными аномалиями, снижены по сравнению с клетками исходных линий hESM01-04.

Выводы (первая часть)

Слайд 16 из 17

18 и её деривата в клетках hESM01r18, хромосомы 9 и её деривата в клетках hESM03der9.
5) На примере хромосомных территорий хромосом r18 и её нормального гомолога показано, что хромосомная перестройка сопровождалась изменением локализации перестроенной хромосомы по сравнению с локализацией её нормального гомолога относительно периферической области ядра и ядрышек. На примере аномалии хромосомы 9 в клетках hESM03der9 и их дифференцированных производных показано, что дуплицированный район, содержащий последовательности, гомологичные прицентромерным повторам, локализуется предпочтительно в периферической области ядра, также как и прицентромерные районы хромосом 9 и её деривата.

Выводы (вторая часть)

Слайд 17 из 17

ДНК проб с ядрами hESM03der9.

3D реконструкция хромосомы 9 и её деривата в пространстве интерфазного ядра клеток сублинии hESM03der9

Здесь лучше видны районы хромосом 9 и её деривата в пространстве, показано как исключить дапийный канал

9,
9С – прицентромерный район хромосомы der(9),
dup9 – дополнительный сигнал на хромосоме der(9).
Хромосомы окрашены красным, сигналы жёлтым.

Один из вариантов локализации районов dup9, 9С и 9N в ядрах клеток hESM03der9 и в ядрах дифференцированных клеток, полученных на основе hESM03der9.

Локализация трёх районов хромосомных территорий хромосом 9 и der(9) в клетках hESM03der9 и их дифференцированных производных

Один из вариантов локализации районов dup9, 9С и 9N в ядрах клеток hESM03der9 и в ядрах дифф клеток, полученных на основе hESM03der9. И обозначение районов dup9, 9N, 9C.

– одной стороной лежит в периферической области ядра;
(С 2) – двумя сторонами лежит в периферической области ядра;
(C nu) – касается ядрышка,
(С 1 + nu) – одной стороной касается ядрышка, другая лежит в периферической области ядра;
0 - не касается ядрышка и не лежит в периферической области ядра.
Зелёным обозначены варианты локализации части хромосомной территории, красным – ядрышки.

Схема: как мы анализировали положение районов девятых хромосом.

эмбриоидных телец. Линия hESM03

Oct-4

АР

Moc-31

СD 105

Десмин

α-фетопротеин

Пример иммуноокрашивания нормальных ЭСК на маркёры плюрипотентности и эмбриоидных телец из них на тканеспецифические маркёры

тельца дериватных клеток

скорости роста клеток дериватных и исходных сублиний

46, ХХ, r(18)

Слайд 5 из 17