Анализ нуклеиновых кислот. Молекулярное клонирование

Август 6, 2022

Главная
Биология
Анализ нуклеиновых кислот. Молекулярное клонирование

Содержание

2. Молекулярное клонирование Этапы Вырезание интересующего участка ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз) Встраивание его в вектор
3. Молекулярное клонирование Эндонуклеазы рестрикции - 3 субъединицы: R, M, S – до 700 кДа - требуют
4. Молекулярное клонирование Эндонуклеазы рестрикции 5’-NNGGATCCNN-3’ 3’-NNCCTAGGNN-5’ 5’-NNAGATCTNN-3’ 3’-NNTCTAGANN-5’ BamH I Bgl II 5’-NNNGATCNNN-3’ 3’-NNNCTAGNNN-5’ Mbo I
5. Молекулярное клонирование Эндонуклеазы рестрикции Изошизомеры – рестриктазы, узнающие одинаковые сайты. GATC Mbo I – A не
6. Молекулярное клонирование Эндонуклеазы рестрикции 5’-NNGAATTCNN-3’ 3’-NNCTTAAGNN-5’ EcoR I pH 7.3, NaCl, MgCl2 * *
7. Молекулярное клонирование Эндонуклеазы рестрикции 5’-NNGAATTCNN-3’ 3’-NNCTTAAGNN-5’ EcoR I pH 7.3, NaCl, MgCl2 5’-NNNAATTNNN-3’ 3’-NNNTTAANNN-5’ Вторичная («штриховая»)
8. Молекулярное клонирование Эндонуклеазы рестрикции 5’-NNGACCGNNNNNNNNNNNN-3’ 3’-NNCTGGCNNNNNNNNNNNN-5’ HgaI (подтип IIS) 5 10
9. Молекулярное клонирование Эндонуклеазы рестрикции 5’-NNGACCGNNNNNNNNNNNN-3’ 3’-NNCTGGCNNNNNNNNNNNN-5’ HgaI (подтип IIS) 5 10 Разрезание 1-цепочечной ДНК в нужном
10. Молекулярное клонирование ДНК-лигазы Наиболее распространенная – из фага T4 Соединяет 5’-фосфат и 3’-OH Требует ATP, Mg2+
11. Молекулярное клонирование Методы получения рекомбинантных ДНК Коннекторный Рестриктазно-лигазный С помощью линкеров
12. Молекулярное клонирование Векторы В качестве векторов используются плазмиды хромосомы вирусов фрагменты эукариотических хромосом
13. Молекулярное клонирование Векторы Необходимые свойства векторной молекулы Возможность встраивания чужеродной ДНК Способность размножаться в клетках хозяина
14. Молекулярное клонирование Введение рекомбинантной ДНК в клетку –трансформация Биологические - вирусы - клеточные рецепторы Химические -
15. Молекулярное клонирование Отбор клеток, содержащих рекомбинантную ДНК Гены устойчивости к антибиотикам Гены ферментов
16. Молекулярное клонирование Отбор клеток, содержащих рекомбинантную ДНК Маркер на основе гена LacZ из лактозного оперона β
17. Молекулярное клонирование Отбор клеток, содержащих рекомбинантную ДНК X-gal (5-бром-4-хлор-3-индоил-β-D-галактопиранозид)
18. Молекулярное клонирование Отбор клеток, содержащих рекомбинантную ДНК Маркер на основе гена LacZ из лактозного оперона В
19. Молекулярное клонирование Плазмидный вектор pBR322
20. Молекулярное клонирование Плазмидный вектор pUC19
21. Молекулярное клонирование Плазмидный вектор pUC19
22. Молекулярное клонирование Плазмидный вектор pUC19
23. Полимеразная цепная реакция .
24. Полимеразная цепная реакция . Компоненты: ДНК-матрица Два праймера, комплементарные концам интересующего фрагмента Термостабильная ДНК-полимераза Дезоксирибонуклеотидтрифосфаты Буферный
25. Полимеразная цепная реакция . minutes
26. Выделение плазмидной ДНК Метод щелочного лизиса Бирнбойма–Доли Лизоцим → разрушение клеточной стенки SDS → разрушение мембраны
28. Скачать презентацию

Слайд 2

Молекулярное клонирование
Этапы
Вырезание интересующего участка ДНК с помощью
эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз)

Встраивание его в вектор с помощью ДНК-лигаз
Введение рекомбинантной ДНК в клетку
Отбор клеток, содержащих рекомбинантную ДНК

Слайд 3

Молекулярное клонирование
Эндонуклеазы рестрикции
- 3 субъединицы: R, M, S – до 700

кДа
- требуют ATP, SAM, Mg2+
- разрезают на значительном и случайном
расстоянии от сайта узнавания
гомодимеры ≈2×30 кДа
- требуют только Mg2+
разрезают в пределах сайта узнавания
в сторго определенном месте
по строению напоминает I тип
требуют ATP, Mg2+
разрезают на расстоянии ≈24–27 нуклеотидов
от сайта узнавания

Разделяют на 3 типа:
I
II
III

Слайд 4

Молекулярное клонирование
Эндонуклеазы рестрикции
5’-NNGGATCCNN-3’
3’-NNCCTAGGNN-5’
5’-NNAGATCTNN-3’
3’-NNTCTAGANN-5’
BamH I
Bgl II
5’-NNNGATCNNN-3’
3’-NNNCTAGNNN-5’
Mbo I
5’-NNNGATCNNN-3’
3’-NNNCTAGNNN-5’
Dpn I
*
*
*
*

Слайд 5

Молекулярное клонирование
Эндонуклеазы рестрикции
Изошизомеры – рестриктазы, узнающие одинаковые сайты.
GATC
Mbo I – A

не метилирован
Dpn I – A метилирован
Sau IIIa – наличие метилирования A безразлично

Гетерошизомеры – изошизомеры, разрезающие
по-разному.
Пример: Mbo I и Dpn I

Слайд 6

Молекулярное клонирование
Эндонуклеазы рестрикции
5’-NNGAATTCNN-3’
3’-NNCTTAAGNN-5’
EcoR I
pH 7.3, NaCl, MgCl2
*
*

Слайд 7

Молекулярное клонирование
Эндонуклеазы рестрикции
5’-NNGAATTCNN-3’
3’-NNCTTAAGNN-5’
EcoR I
pH 7.3, NaCl, MgCl2
5’-NNNAATTNNN-3’
3’-NNNTTAANNN-5’
Вторичная («штриховая») активность:
↓[NaCl], Mg →

*
*

Слайд 8

Молекулярное клонирование
Эндонуклеазы рестрикции
5’-NNGACCGNNNNNNNNNNNN-3’
3’-NNCTGGCNNNNNNNNNNNN-5’
HgaI (подтип IIS)
5
10

Слайд 9

Молекулярное клонирование
Эндонуклеазы рестрикции
5’-NNGACCGNNNNNNNNNNNN-3’
3’-NNCTGGCNNNNNNNNNNNN-5’
HgaI (подтип IIS)
5
10
Разрезание 1-цепочечной ДНК в нужном

месте

Слайд 10

Молекулярное клонирование
ДНК-лигазы
Наиболее распространенная – из фага T4
Соединяет 5’-фосфат и

3’-OH
Требует ATP, Mg2+
Лигирует липкие и тупые концы

Слайд 11

Молекулярное клонирование
Методы получения рекомбинантных ДНК
Коннекторный
Рестриктазно-лигазный
С помощью линкеров

Слайд 12

Молекулярное клонирование
Векторы
В качестве векторов используются
плазмиды
хромосомы вирусов
фрагменты эукариотических хромосом

Слайд 13

Молекулярное клонирование
Векторы
Необходимые свойства векторной молекулы
Возможность встраивания чужеродной ДНК
Способность размножаться

в клетках хозяина
и передаваться в следующие поколения
Наличие селектируемых маркеров

Желательно для вектора на основе плазмиды:

Ослабленный контроль репликации

Слайд 14

Молекулярное клонирование
Введение рекомбинантной ДНК в клетку –трансформация
Биологические
- вирусы
-

клеточные рецепторы
Химические
- ионы металлов
(Ca2+, Rb2+)
- диэтиламиноэтил-декстран
- липосомы

Физические
- электропорация
- лазер
Механические
- микроинъекция
- бомбардировка

Методы:

Слайд 15

Молекулярное клонирование
Отбор клеток, содержащих рекомбинантную ДНК
Гены устойчивости к антибиотикам
Гены

ферментов

Слайд 16

Молекулярное клонирование
Отбор клеток, содержащих рекомбинантную ДНК
Маркер на основе гена LacZ из

лактозного оперона

β - галактозидаза

Слайд 17

Молекулярное клонирование
Отбор клеток, содержащих рекомбинантную ДНК
X-gal (5-бром-4-хлор-3-индоил-β-D-галактопиранозид)

Слайд 18

Молекулярное клонирование
Отбор клеток, содержащих рекомбинантную ДНК
Маркер на основе гена LacZ из

лактозного оперона

В плазмидном векторе:
LacZ’ – 5’-концевой участок LacZ → α-донор
В клетке:
мутация в 5’-концевой области LacZ → α-акцептор
Взаимная комплементация

Слайд 19

Молекулярное клонирование
Плазмидный вектор pBR322

Слайд 20

Молекулярное клонирование
Плазмидный вектор pUC19

Слайд 21

Молекулярное клонирование
Плазмидный вектор pUC19

Слайд 22

Молекулярное клонирование
Плазмидный вектор pUC19

Слайд 23

Полимеразная цепная реакция
.

Слайд 24

Полимеразная цепная реакция
.
Компоненты:
ДНК-матрица
Два праймера, комплементарные концам
интересующего

фрагмента
Термостабильная ДНК-полимераза
Дезоксирибонуклеотидтрифосфаты
Буферный раствор

Слайд 25

Полимеразная цепная реакция
.
minutes

Слайд 26

Выделение плазмидной ДНК
Метод щелочного лизиса Бирнбойма–Доли
Лизоцим → разрушение клеточной стенки

SDS → разрушение мембраны
pH 12 → денатурация хромосомной ДНК
pH 5 → ренатурация плазмидной ДНК
центрифугирование

Анализ нуклеиновых кислот. Молекулярное клонирование

Содержание

Молекулярное клонированиеЭтапы Вырезание интересующего участка ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз)

Молекулярное клонированиеЭндонуклеазы рестрикции- 3 субъединицы: R, M, S – до 700

Молекулярное клонированиеЭндонуклеазы рестрикции5’-NNGGATCCNN-3’3’-NNCCTAGGNN-5’5’-NNAGATCTNN-3’3’-NNTCTAGANN-5’BamH IBgl II5’-NNNGATCNNN-3’3’-NNNCTAGNNN-5’Mbo I5’-NNNGATCNNN-3’3’-NNNCTAGNNN-5’Dpn I* * **

Молекулярное клонированиеЭндонуклеазы рестрикцииИзошизомеры – рестриктазы, узнающие одинаковые сайты.GATCMbo I – A

Молекулярное клонированиеЭндонуклеазы рестрикции5’-NNGAATTCNN-3’3’-NNCTTAAGNN-5’EcoR IpH 7.3, NaCl, MgCl2* *

Молекулярное клонированиеЭндонуклеазы рестрикции5’-NNGAATTCNN-3’3’-NNCTTAAGNN-5’EcoR IpH 7.3, NaCl, MgCl25’-NNNAATTNNN-3’3’-NNNTTAANNN-5’Вторичная («штриховая») активность:↓[NaCl], Mg →

Молекулярное клонированиеЭндонуклеазы рестрикции5’-NNGACCGNNNNNNNNNNNN-3’3’-NNCTGGCNNNNNNNNNNNN-5’HgaI (подтип IIS) 510

Молекулярное клонированиеЭндонуклеазы рестрикции5’-NNGACCGNNNNNNNNNNNN-3’3’-NNCTGGCNNNNNNNNNNNN-5’HgaI (подтип IIS) 510 Разрезание 1-цепочечной ДНК в нужном

Молекулярное клонированиеДНК-лигазы Наиболее распространенная – из фага T4 Соединяет 5’-фосфат и

Молекулярное клонирование Методы получения рекомбинантных ДНК Коннекторный Рестриктазно-лигазный С помощью линкеров

Молекулярное клонированиеВекторыВ качестве векторов используются плазмиды хромосомы вирусов фрагменты эукариотических хромосом

Молекулярное клонированиеВекторыНеобходимые свойства векторной молекулы Возможность встраивания чужеродной ДНК Способность размножаться

Молекулярное клонированиеВведение рекомбинантной ДНК в клетку –трансформация Биологические - вирусы -

Молекулярное клонированиеОтбор клеток, содержащих рекомбинантную ДНК Гены устойчивости к антибиотикам Гены

Молекулярное клонированиеОтбор клеток, содержащих рекомбинантную ДНКМаркер на основе гена LacZ из

Молекулярное клонированиеОтбор клеток, содержащих рекомбинантную ДНКX-gal (5-бром-4-хлор-3-индоил-β-D-галактопиранозид)

Молекулярное клонированиеОтбор клеток, содержащих рекомбинантную ДНКМаркер на основе гена LacZ из

Молекулярное клонированиеПлазмидный вектор pBR322

Молекулярное клонированиеПлазмидный вектор pUC19

Молекулярное клонированиеПлазмидный вектор pUC19

Молекулярное клонированиеПлазмидный вектор pUC19

Полимеразная цепная реакция.

Полимеразная цепная реакция.Компоненты: ДНК-матрица Два праймера, комплементарные концам интересующего

Полимеразная цепная реакция.minutes

Выделение плазмидной ДНКМетод щелочного лизиса Бирнбойма–Доли Лизоцим → разрушение клеточной стенки

Похожие презентации

Молекулярное клонирование
Этапы
Вырезание интересующего участка ДНК с помощью
эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз)

Молекулярное клонирование
Эндонуклеазы рестрикции
- 3 субъединицы: R, M, S – до 700

Молекулярное клонирование
Эндонуклеазы рестрикции
5’-NNGGATCCNN-3’
3’-NNCCTAGGNN-5’
5’-NNAGATCTNN-3’
3’-NNTCTAGANN-5’
BamH I
Bgl II
5’-NNNGATCNNN-3’
3’-NNNCTAGNNN-5’
Mbo I
5’-NNNGATCNNN-3’
3’-NNNCTAGNNN-5’
Dpn I
*
*
*
*

Молекулярное клонирование
Эндонуклеазы рестрикции
Изошизомеры – рестриктазы, узнающие одинаковые сайты.
GATC
Mbo I – A

Молекулярное клонирование
Эндонуклеазы рестрикции
5’-NNGAATTCNN-3’
3’-NNCTTAAGNN-5’
EcoR I
pH 7.3, NaCl, MgCl2
*
*

Молекулярное клонирование
Эндонуклеазы рестрикции
5’-NNGAATTCNN-3’
3’-NNCTTAAGNN-5’
EcoR I
pH 7.3, NaCl, MgCl2
5’-NNNAATTNNN-3’
3’-NNNTTAANNN-5’
Вторичная («штриховая») активность:
↓[NaCl], Mg →

Молекулярное клонирование
Эндонуклеазы рестрикции
5’-NNGACCGNNNNNNNNNNNN-3’
3’-NNCTGGCNNNNNNNNNNNN-5’
HgaI (подтип IIS)
5
10

Молекулярное клонирование
Эндонуклеазы рестрикции
5’-NNGACCGNNNNNNNNNNNN-3’
3’-NNCTGGCNNNNNNNNNNNN-5’
HgaI (подтип IIS)
5
10
Разрезание 1-цепочечной ДНК в нужном

Молекулярное клонирование
ДНК-лигазы
Наиболее распространенная – из фага T4
Соединяет 5’-фосфат и

Молекулярное клонирование
Методы получения рекомбинантных ДНК
Коннекторный
Рестриктазно-лигазный
С помощью линкеров

Молекулярное клонирование
Векторы
В качестве векторов используются
плазмиды
хромосомы вирусов
фрагменты эукариотических хромосом

Молекулярное клонирование
Векторы
Необходимые свойства векторной молекулы
Возможность встраивания чужеродной ДНК
Способность размножаться

Молекулярное клонирование
Введение рекомбинантной ДНК в клетку –трансформация
Биологические
- вирусы
-

Молекулярное клонирование
Отбор клеток, содержащих рекомбинантную ДНК
Гены устойчивости к антибиотикам
Гены

Молекулярное клонирование
Отбор клеток, содержащих рекомбинантную ДНК
Маркер на основе гена LacZ из

Молекулярное клонирование
Отбор клеток, содержащих рекомбинантную ДНК
X-gal (5-бром-4-хлор-3-индоил-β-D-галактопиранозид)

Молекулярное клонирование
Отбор клеток, содержащих рекомбинантную ДНК
Маркер на основе гена LacZ из

Молекулярное клонирование
Плазмидный вектор pBR322

Молекулярное клонирование
Плазмидный вектор pUC19

Молекулярное клонирование
Плазмидный вектор pUC19

Молекулярное клонирование
Плазмидный вектор pUC19

Полимеразная цепная реакция
.

Полимеразная цепная реакция
.
Компоненты:
ДНК-матрица
Два праймера, комплементарные концам
интересующего

Полимеразная цепная реакция
.
minutes

Выделение плазмидной ДНК
Метод щелочного лизиса Бирнбойма–Доли
Лизоцим → разрушение клеточной стенки