Биология стволовых клеток: общие понятия

Август 6, 2022

Главная
Биология
Биология стволовых клеток: общие понятия

Содержание

2. КРИТЕРИИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК Lajtha (1979) Стволовые клетки – самоподдерживающаяся клеточная субпопуляция Стволовые клетки содержатся в тканях
3. КРИТЕРИИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК C. M. Verfillie (2004) Стволовые клетки способны самообновляться, давая начало хотя-бы одной дочерней
4. Стволовые клетки эмбриональные тканеспецифические (фетальные и постнатальные)
5. Тотипотентные Плюрипотентные Мультипотентные Унипотентные По: Wagers, Weissman, 2004 Зигота ЭСК Мезенхимальная стволовая клетка, Кроветворная стволовая клетка,
7. Эмбриональные стволовые клетки
8. Постнатальные стволовые клетки Гемопоэтические стволовые клетки
9. МЕЗЕНХИМНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ МУЛЬТИПОТЕНТНЫЕ МЕЗЕНХИМНЫЕ СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ Максимов А.А. 1915 Фриденштейн А.Я. 1976, 1987 Каплан А.
10. Локализация стволовых клеток в различных типах эпителия (Miller et al., 1993)
11. Мультипотентные СК
12. Цитогенез нейральных стволовых клеток НСК Neuroepithelial cells Pax6, Sox1-2 nestin Embryonic and perinatal VZ/SVZ Pax6, GLAST,
13. Стволовые клетки сердца
14. Ассиметричное деление стволовых клеток
15. Микроокружение стволовых клеток - В состав ниши входят окружающие клетки, внеклеточный матрикс и молекулярная среда. В
16. Пластичность тканеспецифических стволовых клеток - Способность клеток дифференцироваться через границы тканей и зародышевых листков 1. Популяционное
17. Хоуминг и мобилизация (онтогенез, регенерация, канцерогенез) ММР-9 хемокины Травма, воспаление, радиационное поражение, гипоксия Циркуляция клеток в
18. Возможное клиническое применение стволовых клеток Трофическое влияние на ткани и органы Стимуляция васкуляризации Индукция регенерации Иммунокоррегирующие
19. Результаты использования клеточных технологий Полученные Ожидаемые Нейродегенеративные заболевания Инфаркт Инсульт Патологии печени Аутоиммунные заболевания Реконструкция иммунной
20. Известные к сегодняшнему дню эквиваленты тканей: Живой эквивалент кожи Эквиваленты сосудов Эквивалент хряща Эквивалент печени Эквивалент
21. Взаимодействие стволовых клеток с опухолью
22. Мобилизация/Хоминг CXCR4/SDF-1 MCP-1 TIMP-1 Трансмиграция VLA-4/CD49d/α4 MMP-2 MT1-MMP TIMP-2 Метастазы MCP-1 CCL5/RANTES МСК обладают способностью к
23. Фундаментальные исследования Dai et al., 2011 Galderisi et al.,2010 Возможные направления лечебного действия СК Применение МСК
24. Методы in vivo визуализации миграции и распределения экзогенных ММСК Zhao et al., 2010; Reagan et al.,2011
25. Установка для поверхностного флуоресцентного имиджинга (ИПФ РАН, Россия) •Источник: светодиоды Цифровая камера Hamamatsu ORCA2 Конфигурация «на
26. Стволовые клетки человека СКЖТ- Turbo FP635 Стволовые клетки мыши ММСК - GFP(+) Стволовые клетки человека ММСК
27. lung Мониторинг распределения СКЖТ-Turbo FP635 методом флуоресцентного имиджинга in vivo и ex vivo Внутривенное введение СКЖТ-Turbo
28. Мониторинг распределения ММСК - GFP(+) методами флуоресцентного имиджинга ex vivo и проточной цитометрии костный мозг Возбуждение
29. Мониторинг формирования метастазов опухолевыми клетками MDA-MB-231-Turbo FP650 методом флуоресцентного имиджинга in vivo и ex vivo Возбуждение
30. животные с метастатической опухолью и введением ММСК – luc2 СК ингибируют формирование метастазов карциномы молочной железы
31. Заключение: Экзогенные Мезенхимные стволовые клетки: Не аккумулируются в первичных опухолях и не влияют на опухолевый рост
32. Метаболизм стволовых клеток • Пролиферирующие клетки требуют большого количества энергии (ATФ) и коферментов (НАД(Ф)Н), энергетический распад
33. Внутриклеточные флуорофоры – НАДН и ФАД флуоресценция
34. Методы исследования морфологии и физиологии стволовых клеток Признак Метод Клеточные маркеры • Проточная цитометрия • Иммуногистохимия
35. Принцип метода FLIM микроскопии
36. Принцип метода FLIM микроскопии Распределение времен жизни флуоресценции описывается экспоненциальной функцией затухания Визуализация времени жизни флуоресфенции
37. Материалы и методы • МСК – мезенхимные стволовые клетки костного мозга человека LSM 710 лазерный сканирующий
38. а1 (%) – вклад короткой компоненты во время жизни флуоресценции τ1 (ps) – время жизни флуоресценции
39. Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy Регистрируемые FLIM параметры Свободная форма НАД(Ф)Н растворенная форма кофермента цитозоль - 0,3±0,05
40. Разделение времен жизни связанных форм НАДН и НАД(Ф)Н при адипогенной дифференцировке I. Georgakoudi, K.P. Quinn, Annu.Rev.Biomed.Eng.
41. τ2 (ns) – время жизни флуоресценции длинной компоненты, соответствует времени жизни связанной нефосфорилированной формы НАДН τ3
42. Увеличение метаболической активности Исследование окислительно-восстановительного статуса МСК в процессе адипогенной дифференцировки методом LSM Окислительно-восстановительный коэффициент =
43. Исследование метаболического статуса и синтеза жирных кислот в МСК в процессе адипогенной дифференцировки методом FLIM связанной
44. Исследование окислительно-восстановительного статуса МСК в процессе остеогенной и ходногенной дифференцировок методом LSM Увеличение метаболической активности
45. Исследование метаболического статуса в МСК в процессе остеогенной дифференцировки методом FLIM связанной формы НАДН = переход
46. Исследование метаболического статуса в МСК в процессе хондрогенной дифференцировки методом FLIM связанной формы НАДН = переход
47. Исследование синтеза коллагена в МСК в процессе остеогенной и хондрогенной дифференцировок методом LSM и FLIM Недифференцированные
48. Заключение Хондрогенная дифференцировка Остеогенная дифференцировка Адипогенная дифференцировка Переключение с гликолиза на ОКФОС + Биосинтез жирных кислот
50. Скачать презентацию

Слайд 2

КРИТЕРИИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
Lajtha (1979)
Стволовые клетки – самоподдерживающаяся клеточная субпопуляция
Стволовые клетки содержатся

в тканях в состоянии пролиферативного покоя или крайне медленно циклируют
Содержание стволовых клеток в тканях крайне низкое в пределах 1-3%
Стволовые клетки активируются при повреждении
Стволовые клетки дают начало дифференцированным и стволовым клеткам

Слайд 3

КРИТЕРИИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
C. M. Verfillie (2004)
Стволовые клетки способны самообновляться, давая начало

хотя-бы одной дочерней клетке с характеристиками стволовых.
Стволовые клетки способны проходить дифференцировку давая начало предшественникам, прогениторным и терминально дифференцированным клеткам.
Стволовые клетки репопулируют ткань in vivo, обеспечивая функциональное, структурное или морфологическое подобие.

Слайд 4

Стволовые клетки
эмбриональные
тканеспецифические
(фетальные и постнатальные)

Слайд 5

Тотипотентные
Плюрипотентные
Мультипотентные
Унипотентные
По: Wagers, Weissman, 2004
Зигота
ЭСК
Мезенхимальная стволовая клетка, Кроветворная стволовая клетка,

Эпидермальная стволовая клетка
Сателлитная клетка мышц

Эмбриональные
Фетальные
Взрослые
По: M. Rao, 2004

Классификация стволовых клеток:

Слайд 6

Слайд 7

Эмбриональные стволовые клетки

Слайд 8

Постнатальные стволовые клетки
Гемопоэтические стволовые клетки

Слайд 9

МЕЗЕНХИМНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ
МУЛЬТИПОТЕНТНЫЕ МЕЗЕНХИМНЫЕ СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ
Максимов А.А. 1915
Фриденштейн А.Я. 1976,

1987
Каплан А. (Caplan A.) 1991

Адгезивность к пластику в стандартных условиях in vitro;
Способность к дифференцировке in vitro в остеобласты, хондробласты и адипоциты;
Экспрессия специфических поверхностных маркеров.

«+» «-»
CD105 (эндоглин, CD45 – лейкоциты
рецептор к TGFβ) CD34 – кроветворные и CD73 (экто-5’-нуклеотидаза) эндотелиальные клетки
CD90 (Thy1 – семейство CD14 и CD11b – макрофаги
иммуноглобулинов) и моноциты
CD79a и CD19 – B лимфоциты
HLA-DR

Слайд 10

Локализация стволовых клеток в различных типах эпителия (Miller et al., 1993)

Слайд 11

Мультипотентные СК

Слайд 12

Цитогенез нейральных стволовых клеток
НСК
Neuroepithelial cells
Pax6, Sox1-2 nestin
Embryonic and perinatal VZ/SVZ
Pax6, GLAST,

TN-C, S100b, vimentin, nestin, BLBP, RG

Postnatal/Adult SVZ
Pax6, GFAP, GLAST, TN-C, vimentin, SSEA1, Musashi1, TERT, ABCG2, Notch(Hes5)…

М.Александрова, ИБР РАН

Слайд 13

Стволовые клетки сердца

Слайд 14

Ассиметричное деление стволовых клеток

Слайд 15

Микроокружение стволовых клеток
- В состав ниши входят окружающие клетки, внеклеточный матрикс

и молекулярная среда. В матриксе находятся регуляторные молекулы, в частности факторы роста, интегрины, кадгерины.
-Ниши хорошо снабжены кровеносными сосудами и нервными окончаниями, и кроме того, обеспечивают физическую защиту.

Слайд 16

Пластичность тканеспецифических стволовых клеток
- Способность клеток дифференцироваться через границы тканей и

зародышевых листков
1. Популяционное разнообразие
2. Слияние клеток
3. Плюрипотентные стволовые клетки

Слайд 17

Хоуминг и мобилизация
(онтогенез, регенерация, канцерогенез)
ММР-9
хемокины
Травма, воспаление, радиационное поражение, гипоксия
Циркуляция клеток в

норме и при патологии

Ниша
Базальная мембрана, матрикс

мобилизация

заполнение ниши

Слайд 18

Возможное клиническое применение стволовых клеток
Трофическое влияние на ткани и органы
Стимуляция васкуляризации
Индукция

регенерации
Иммунокоррегирующие и иммуносупрессивные свойства
Противошоковое действие

Слайд 19

Результаты использования клеточных технологий
Полученные Ожидаемые
Нейродегенеративные заболевания
Инфаркт
Инсульт
Патологии печени
Аутоиммунные заболевания
Реконструкция иммунной системы
Диабет
Восстановление

костного мозга
Кожа (ожоги, раны)
Роговица
Хрящ
Кость
Сосуды
Спинальная травма

Слайд 20

Известные к сегодняшнему дню эквиваленты тканей:
Живой эквивалент кожи
Эквиваленты сосудов
Эквивалент хряща
Эквивалент печени
Эквивалент

мочевого пузыря
Эквивалент уретры
Эквивалент роговицы

Слайд 21

Взаимодействие стволовых клеток
с опухолью

Слайд 22

Мобилизация/Хоминг
CXCR4/SDF-1
MCP-1
TIMP-1
Трансмиграция
VLA-4/CD49d/α4
MMP-2
MT1-MMP
TIMP-2
Метастазы
MCP-1
CCL5/RANTES
МСК обладают способностью к миграции и хомингу к опухолям
МСК
Yen et al.,

2008

Слайд 23

Фундаментальные исследования
Dai et al., 2011
Galderisi et al.,2010
Возможные направления лечебного действия СК
Применение

МСК
для доставки лекарств
в опухоль

Не влияют на рост
опухолей

Апоптоз

Подавление инвазии

Sasportas et al., 2009

Xia et al., 2011

Подавление развития метастазов

TGFβ1, MMP-2

Wnt,Akt, NFkB
сигнальные пути

Терапевтическое действие через блокировку механизмов
хоминга МСК

Создание противоопухолевых клеточных препаратов на основе МСК

Слайд 24

Методы in vivo визуализации миграции и распределения экзогенных ММСК
Zhao et

al., 2010; Reagan et al.,2011

Есть задача изучения накопления МСК в опухоли во времени,
их влияния на опухоль

Методы флуоресцентного имиджинга,
использующие
генетически-кодируемые красители, которые позволяют решить эту задачу

Слайд 25

Установка для
поверхностного
флуоресцентного
имиджинга
(ИПФ РАН, Россия)
•Источник: светодиоды
Цифровая

камера Hamamatsu ORCA2
Конфигурация «на отражении»

Инвертированный микроскоп X71 (Olympus, Япония/Германия
•Комплекс оптической микроскопии, фазового
контраста и флюоресценции

Флуоресцентный имиджинг

IVIS Spectrum (Caliper Life Sciences,USA)
•Источник: широкополосная лампа
•Цифровая охлаждаемая CDD-камера
•Конфигурация «на отражении»
• Флуоресценция и биолюминесценция

Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп
LSM 510 (Carl Zeiss,
Germany)
•Моторизированный инвертированный микроскоп Carl Zeiss Axiovert 200 MOT
•Спектральный модуль Carl Zeiss 23 META

на уровне целого организма in vivo

на уровне клеток ex vivo

Слайд 26

Стволовые клетки человека
СКЖТ- Turbo FP635
Стволовые клетки мыши
ММСК - GFP(+)
Стволовые

клетки человека
ММСК – luc2

Pак шейки матки человека (HeLa)

Эпидермоидная карцинома легкого мыши (LLC)

Аденокарцинома молочной железы человека
(MDA-MB-231-Turbo FP650)

Мыши C57Bl6

Мыши nu/nu

Модели подкожного первичного узла

Модель легочных метастазов

Исследование распределения СК в организме животного-опухоленосителя
Исследование накопления СК в опухоли
Оценка роста первичного узла
Оценка роста метастазов

СК вводились локально или внутривенно на 0-й или 8-й день после прививки опухолевых клеток

СК вводились внутривенно на 10-й день после инъекции опухолевых клеток

n=18

n=15

Слайд 27

lung
Мониторинг распределения СКЖТ-Turbo FP635 методом флуоресцентного имиджинга in vivo и ex

vivo

Внутривенное введение СКЖТ-Turbo FP635 на 0 день

контроль

Возбуждение - 585 нм
Детекция - 628-672 нм

СК не оказывают влияния на рост
рака шейки матки человека (HeLa)

селезенка

9 день 12 день 14 день

Возбуждение – 543 nm
Детекция - 650-710 nm

Внутривенное введение
СКЖТ-Turbo FP635 на 8 день

СКЖТ-Turbo FP635 аккумулируются в опухоли при локальном введении

Meleshina A.V. et al.Proc. SPIE, 2013, Vol. 8587, 8587- 1S - (8P).

Локальное введение
СКЖТ-Turbo FP635 на 0 день

Слайд 28

Мониторинг распределения ММСК - GFP(+) методами флуоресцентного имиджинга ex vivo и

проточной цитометрии

костный мозг

Возбуждение - 488 нм,
Детекция - 515-545 нм

Возбуждение - 488 нм,
Детекция - 490-600 нм

единичные ММСК - GFP(+) накапливаются в опухоли при внутривенном введении, но не пролиферируют

СК не оказывают влияния на рост
карциномы легкого мыши

Meleshina A.V. et al.
Proc. SPIE, 2013, Vol. 8587

12день
после трансплантации

15день
после трансплантации

Слайд 29

Мониторинг формирования метастазов опухолевыми клетками MDA-MB-231-Turbo FP650 методом флуоресцентного имиджинга
in vivo

и ex vivo

Возбуждение - 605 нм
Детекция - 660 нм

Meleshina A.V. et al. Stem Cell Research & Therapy, (2015) 6:15 ,13287-015

4 неделя 6 неделя 7 неделя 8 неделя

животные с метастатической опухолью и введением ММСК – luc2

животные с метастатической опухолью без введения ММСК – luc2

4 неделя 6 неделя 7 неделя 8 неделя

контроль

легкие животных с метастатической опухолью и введением ММСК – luc2

легкие животных с метастатической опухолью без введения ММСК – luc2

Слайд 30

животные с метастатической опухолью и введением ММСК – luc2
СК ингибируют формирование

метастазов карциномы молочной железы человека

иммуногистохимия легочной
ткани с метастазами

Мониторинг распределения ММСК – luc2 методами двойного
(флуоресцентного и биолюминесцентного) имиджинга

Окрашивание антителами к ffluc

Meleshina A.V. et al. Stem Cell Research & Therapy, (2015) 6:15 ,13287-015

4 неделя 6 неделя 7 неделя 8 неделя

животные с метастатической опухолью без введения ММСК – luc2

легкие животных с метастатической опухолью и введением ММСК – luc2

Слайд 31

Заключение:
Экзогенные Мезенхимные стволовые клетки:
Не аккумулируются в первичных опухолях и не

влияют на опухолевый рост
Мигрируют в легкие, пролиферируют и ингибируют метастазы

Слайд 32

Метаболизм стволовых клеток
• Пролиферирующие клетки требуют большого количества энергии (ATФ) и

коферментов (НАД(Ф)Н), энергетический распад глюкозы через гликолиз и пентозо-фосфатный путь
• Дифференцированные клетки требуют большого количества энергии для поддержания клеточного гомеостаза и высокоспециализированных функций, продукция АТФ через окислительное фосфорилирование

C. D.L. Folmes et al., Cell Stem Cell , №11, 2012

Слайд 33

Внутриклеточные флуорофоры – НАДН и ФАД
флуоресценция

Слайд 34

Методы исследования морфологии и физиологии стволовых клеток
Признак
Метод
Клеточные маркеры
• Проточная цитометрия
• Иммуногистохимия
•

имммуно-сортинг клеток с помощью магнитного поля

Генотип

• Полимеразная цепная реакция

Потенции к дифференцировкам

• Иммуноцитохимия
• Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy
(FLIM)

Неинвазивность
Высокая чувствительность и специфичность
Информативность
Не требует экзогенных маркеров
Позволяет в течение длительного времени изучать функциональные изменения

K. Konig, 2011; Becker, W., 2005

Слайд 35

Принцип метода FLIM микроскопии

Слайд 36

Принцип метода FLIM микроскопии
Распределение времен жизни флуоресценции описывается экспоненциальной
функцией затухания

Визуализация времени жизни флуоресфенции

Слайд 37

Материалы и методы
• МСК – мезенхимные стволовые клетки костного мозга человека
LSM

710 лазерный сканирующий
конфокальный микроскоп
(Carl Zeiss, Germany)
FLIM система на основе
Simple Tau 152 TCSPC system
(Becker & Hickl GmbH)

Никотинамид аденин динуклеотид (фосфат), НАД(Ф)Н: возбуждение - 750 нм, детекция - 455-500 нм
Флавин аденин динуклеотид, ФАД: возбуждение - 900 нм, детекция – 500-550 нм

Слайд 38

а1 (%) – вклад короткой компоненты во время жизни флуоресценции
τ1 (ps)

– время жизни флуоресценции короткой компоненты, соответствует времени жизни свободной формы НАД(Ф)Н
а2 (%) - вклад длинной компоненты во время жизни флуоресценции
τ2 (ps) – время жизни флуоресценции длинной компоненты, соответствует времени жизни связанной формы НАД(Ф)Н

Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Регистрируемые FLIM параметры

a1
τ1
a2
τ2

Слайд 39

Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy
Регистрируемые FLIM параметры
Свободная форма НАД(Ф)Н
растворенная форма кофермента
цитозоль

- 0,3±0,05 нс
Связанная форма НАД(Ф)Н,
форма кофермента, который входит в
состав апофермента,
связан с белками
на мембране митохондрий - 2,0±0,3 нс

гликолиз

ОКФОС

Слайд 40

Разделение времен жизни связанных форм НАДН и НАД(Ф)Н при адипогенной дифференцировке
I.

Georgakoudi, K.P. Quinn, Annu.Rev.Biomed.Eng. 2012.14:351–67

Слайд 41

τ2 (ns) – время жизни флуоресценции длинной компоненты, соответствует времени жизни

связанной нефосфорилированной формы НАДН
τ3 (ns) – время жизни флуоресценции длинной компоненты, соответствует времени жизни связанной фосфорилированной формы НАДН
а2 (%) - вклад длинной компоненты во время жизни флуоресценции соответствует вкладу связанной нефосфорилированной формы НАДН
а3 (%) - вклад длинной компоненты во время жизни флуоресценции соответствует вкладу связанной фосфорилированной формы НАДН

Разделение времен жизни связанных форм НАДН и НАД(Ф)Н при адипогенной дифференцировке

Слайд 42

Увеличение
метаболической активности
Исследование окислительно-восстановительного статуса МСК в процессе адипогенной дифференцировки методом

LSM

Окислительно-восстановительный коэффициент =
отношение интенсивностей флуоресценции ФАД/НАД(Ф)Н

Слайд 43

Исследование метаболического статуса и синтеза жирных кислот в МСК в процессе

адипогенной дифференцировки методом FLIM

связанной формы НАДН
=
переход на ОКФОС

связанной формы НАД(Ф)Н
=
активация синтеза липидов

Слайд 44

Исследование окислительно-восстановительного статуса МСК в процессе остеогенной и ходногенной дифференцировок методом

LSM

Увеличение
метаболической активности

Слайд 45

Исследование метаболического статуса в МСК в процессе остеогенной дифференцировки методом FLIM

связанной формы НАДН
=
переход на гликолиз

Слайд 46

Исследование метаболического статуса в МСК в процессе хондрогенной дифференцировки методом FLIM

связанной формы НАДН
=
переход на гликолиз

Слайд 47

Исследование синтеза коллагена в МСК в процессе остеогенной и хондрогенной дифференцировок

методом LSM и FLIM

Недифференцированные
МСК

Остеогенная
дифференцировка
21й день

Хондрогенная
дифференцировка
21й день

Синтез коллагена

Окрашивание на коллаген по Ван Гизону

Слайд 48

Заключение
Хондрогенная
дифференцировка
Остеогенная
дифференцировка
Адипогенная
дифференцировка
Переключение
с гликолиза
на ОКФОС
+
Биосинтез
жирных кислот
Переключение
с гликолиза
на ОКФОС
и снова на
гликолиз
+
Синтез
коллагена
Переключение
на

более
гликолитичный статус

Синтез
коллагена

Метаболическая пластичность МСК

Биология стволовых клеток: общие понятия

Содержание

КРИТЕРИИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОКLajtha (1979)Стволовые клетки – самоподдерживающаяся клеточная субпопуляцияСтволовые клетки содержатся

КРИТЕРИИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОКC. M. Verfillie (2004)Стволовые клетки способны самообновляться, давая начало

Стволовые клеткиэмбриональныетканеспецифические(фетальные и постнатальные)

Тотипотентные ПлюрипотентныеМультипотентныеУнипотентные По: Wagers, Weissman, 2004ЗиготаЭСКМезенхимальная стволовая клетка, Кроветворная стволовая клетка,

Эмбриональные стволовые клетки

Постнатальные стволовые клеткиГемопоэтические стволовые клетки

МЕЗЕНХИМНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИМУЛЬТИПОТЕНТНЫЕ МЕЗЕНХИМНЫЕ СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИМаксимов А.А. 1915 Фриденштейн А.Я. 1976,

Локализация стволовых клеток в различных типах эпителия (Miller et al., 1993)

Мультипотентные СК

Цитогенез нейральных стволовых клетокНСКNeuroepithelial cellsPax6, Sox1-2 nestinEmbryonic and perinatal VZ/SVZPax6, GLAST,

Стволовые клетки сердца

Ассиметричное деление стволовых клеток

Микроокружение стволовых клеток- В состав ниши входят окружающие клетки, внеклеточный матрикс

Пластичность тканеспецифических стволовых клеток- Способность клеток дифференцироваться через границы тканей и

Хоуминг и мобилизация(онтогенез, регенерация, канцерогенез)ММР-9хемокиныТравма, воспаление, радиационное поражение, гипоксияЦиркуляция клеток в

Возможное клиническое применение стволовых клетокТрофическое влияние на ткани и органыСтимуляция васкуляризацииИндукция

Известные к сегодняшнему дню эквиваленты тканей:Живой эквивалент кожиЭквиваленты сосудовЭквивалент хрящаЭквивалент печениЭквивалент

Взаимодействие стволовых клеток с опухолью

Мобилизация/ХомингCXCR4/SDF-1MCP-1TIMP-1ТрансмиграцияVLA-4/CD49d/α4MMP-2MT1-MMPTIMP-2МетастазыMCP-1CCL5/RANTESМСК обладают способностью к миграции и хомингу к опухолямМСКYen et al.,

Фундаментальные исследованияDai et al., 2011Galderisi et al.,2010Возможные направления лечебного действия СКПрименение

Методы in vivo визуализации миграции и распределения экзогенных ММСК Zhao et

Установка для поверхностного флуоресцентного имиджинга(ИПФ РАН, Россия) •Источник: светодиоды Цифровая

Стволовые клетки человекаСКЖТ- Turbo FP635 Стволовые клетки мышиММСК - GFP(+) Стволовые

lungМониторинг распределения СКЖТ-Turbo FP635 методом флуоресцентного имиджинга in vivo и ex

Мониторинг распределения ММСК - GFP(+) методами флуоресцентного имиджинга ex vivo и

Мониторинг формирования метастазов опухолевыми клетками MDA-MB-231-Turbo FP650 методом флуоресцентного имиджингаin vivo

животные с метастатической опухолью и введением ММСК – luc2СК ингибируют формирование

Заключение:Экзогенные Мезенхимные стволовые клетки: Не аккумулируются в первичных опухолях и не

Метаболизм стволовых клеток• Пролиферирующие клетки требуют большого количества энергии (ATФ) и

Внутриклеточные флуорофоры – НАДН и ФАДфлуоресценция

Методы исследования морфологии и физиологии стволовых клетокПризнакМетодКлеточные маркеры• Проточная цитометрия• Иммуногистохимия•

Принцип метода FLIM микроскопии

Принцип метода FLIM микроскопииРаспределение времен жизни флуоресценции описывается экспоненциальной функцией затухания

Материалы и методы• МСК – мезенхимные стволовые клетки костного мозга человекаLSM

а1 (%) – вклад короткой компоненты во время жизни флуоресценцииτ1 (ps)

Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy Регистрируемые FLIM параметрыСвободная форма НАД(Ф)Нрастворенная форма коферментацитозоль

Разделение времен жизни связанных форм НАДН и НАД(Ф)Н при адипогенной дифференцировкеI.

τ2 (ns) – время жизни флуоресценции длинной компоненты, соответствует времени жизни

Увеличение метаболической активностиИсследование окислительно-восстановительного статуса МСК в процессе адипогенной дифференцировки методом

Исследование метаболического статуса и синтеза жирных кислот в МСК в процессе

Исследование окислительно-восстановительного статуса МСК в процессе остеогенной и ходногенной дифференцировок методом

Исследование метаболического статуса в МСК в процессе остеогенной дифференцировки методом FLIM

Исследование метаболического статуса в МСК в процессе хондрогенной дифференцировки методом FLIM

Исследование синтеза коллагена в МСК в процессе остеогенной и хондрогенной дифференцировок

Похожие презентации

КРИТЕРИИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
Lajtha (1979)
Стволовые клетки – самоподдерживающаяся клеточная субпопуляция
Стволовые клетки содержатся

КРИТЕРИИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
C. M. Verfillie (2004)
Стволовые клетки способны самообновляться, давая начало

Стволовые клетки
эмбриональные
тканеспецифические
(фетальные и постнатальные)

Тотипотентные
Плюрипотентные
Мультипотентные
Унипотентные
По: Wagers, Weissman, 2004
Зигота
ЭСК
Мезенхимальная стволовая клетка, Кроветворная стволовая клетка,

Постнатальные стволовые клетки
Гемопоэтические стволовые клетки

МЕЗЕНХИМНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ
МУЛЬТИПОТЕНТНЫЕ МЕЗЕНХИМНЫЕ СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ
Максимов А.А. 1915
Фриденштейн А.Я. 1976,

Цитогенез нейральных стволовых клеток
НСК
Neuroepithelial cells
Pax6, Sox1-2 nestin
Embryonic and perinatal VZ/SVZ
Pax6, GLAST,

Микроокружение стволовых клеток
- В состав ниши входят окружающие клетки, внеклеточный матрикс

Пластичность тканеспецифических стволовых клеток
- Способность клеток дифференцироваться через границы тканей и

Хоуминг и мобилизация
(онтогенез, регенерация, канцерогенез)
ММР-9
хемокины
Травма, воспаление, радиационное поражение, гипоксия
Циркуляция клеток в

Возможное клиническое применение стволовых клеток
Трофическое влияние на ткани и органы
Стимуляция васкуляризации
Индукция

Известные к сегодняшнему дню эквиваленты тканей:
Живой эквивалент кожи
Эквиваленты сосудов
Эквивалент хряща
Эквивалент печени
Эквивалент

Взаимодействие стволовых клеток
с опухолью

Мобилизация/Хоминг
CXCR4/SDF-1
MCP-1
TIMP-1
Трансмиграция
VLA-4/CD49d/α4
MMP-2
MT1-MMP
TIMP-2
Метастазы
MCP-1
CCL5/RANTES
МСК обладают способностью к миграции и хомингу к опухолям
МСК
Yen et al.,

Фундаментальные исследования
Dai et al., 2011
Galderisi et al.,2010
Возможные направления лечебного действия СК
Применение

Методы in vivo визуализации миграции и распределения экзогенных ММСК
Zhao et

Установка для
поверхностного
флуоресцентного
имиджинга
(ИПФ РАН, Россия)
•Источник: светодиоды
Цифровая

Стволовые клетки человека
СКЖТ- Turbo FP635
Стволовые клетки мыши
ММСК - GFP(+)
Стволовые

lung
Мониторинг распределения СКЖТ-Turbo FP635 методом флуоресцентного имиджинга in vivo и ex

Мониторинг формирования метастазов опухолевыми клетками MDA-MB-231-Turbo FP650 методом флуоресцентного имиджинга
in vivo

животные с метастатической опухолью и введением ММСК – luc2
СК ингибируют формирование

Заключение:
Экзогенные Мезенхимные стволовые клетки:
Не аккумулируются в первичных опухолях и не

Метаболизм стволовых клеток
• Пролиферирующие клетки требуют большого количества энергии (ATФ) и

Внутриклеточные флуорофоры – НАДН и ФАД
флуоресценция

Методы исследования морфологии и физиологии стволовых клеток
Признак
Метод
Клеточные маркеры
• Проточная цитометрия
• Иммуногистохимия
•

Принцип метода FLIM микроскопии
Распределение времен жизни флуоресценции описывается экспоненциальной
функцией затухания

Материалы и методы
• МСК – мезенхимные стволовые клетки костного мозга человека
LSM

а1 (%) – вклад короткой компоненты во время жизни флуоресценции
τ1 (ps)

Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy
Регистрируемые FLIM параметры
Свободная форма НАД(Ф)Н
растворенная форма кофермента
цитозоль

Разделение времен жизни связанных форм НАДН и НАД(Ф)Н при адипогенной дифференцировке
I.

Увеличение
метаболической активности
Исследование окислительно-восстановительного статуса МСК в процессе адипогенной дифференцировки методом