Экспрессия трансгенов

Слайд 3

Структура домена хроматина, содержащего ген овальбумина (ОА) и координированно экспрессирующиеся с

ним гены (Х и Y)

Повторы - инсуляторы

20 кб

x y ОА

Слайд 4

Искусственная хромосома дрожжей

Слайд 5

о
6 12 18 24 30 36 6 12 18 24

30 36 42 (недели)

Рождение

Слайд 6

Schematic of genomic structural organization of the human α-globin and β-globin

loci and temporal expression of the various hemoglobin types.

Wilber A et al. Blood 2011;117:3945-3953

Структура кластеров глобиновых генов человека

Слайд 7

Schematic of hemoglobin switching model based on looping and interaction of

the LCR with the individual β-globin gene promoters.

Wilber A et al. Blood 2011;117:3945-3953

Слайд 8

Вариант метода вычитающей гибридизации
Клонирование и анализ (трансгеноз)
Злокачественные клетки
Нормальные клетки
мРНК
В избытке

Слайд 9

Array CGH (Comparative Genomic Hybridization technology).
Делеция
Дупликация
Контрольная ДНК
Исследуемая ДНК

Слайд 10

От хромосомных перестроек - к механизмам злокачественного перерождения через трансгеноз
-Транслокация

хромосом t(9;22) у человека при лимфобластической лейкемии –
- обнаружение слитых генов Bcr/Abl –
- получение трансгенных мышей с такой конструкцией под контролем МТ-промотора –
- возникновение у них лимфобластической лейкемии

Слайд 11

Влияние экспрессии онкогенов на канцерогенез у трансгенных мышей

Слайд 12

Клеточные гены, ускоряющие развитие лимфомы у трансгенных мышей

Слайд 13

Синергизм трансгенов в лимфомогенезе у двойных трансгенных мышей

Слайд 14

Детектирование синергичных в лимфомогенезе генов с помощью инсерций провирусов у трансгенных

мышей

Слайд 15

1. Моделирование серповидноклеточной анемии у трансгенных мышей
альфа1
альфа2
Бета S
Локус-контролирующая область (LCR)
Глобиновые

гены человека

2. Моделирование болезни Альцгеймера у трансгенных мышей

Тройная трансгенная мышь, содержащая мутантные гены пресенилина, аполипопротеина и белка tau. Протективный эффект гуманина.

Замена глутаминовой кислоты на валин

Слайд 16

Некоторые другие проблемы, решаемые с помощью трансгеноза.
Токсикогенетика развития.
Генетическая замена микрохирургии –

ген дифтерийного токсина А с промотором гена эластина – уничтожение поджелудочной железы.
2. Трансген – хромосомный маркер.
Ген трансферрина кур в инактивированной Х-хромосоме работает.
3. Исследование вирусного патогенеза – функциональная анатомия.
Трансгенные мыши с генами tat и nef ВИЧ.

Слайд 17

Структура генома ВИЧ-1

Слайд 18

Взаимодействие регуляторных белков с LTR ВИЧ-1
Tat

Слайд 19

ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ

Слайд 20

Генная терапия in vivo
Генная терапия ex vivo
Размножение клеток in vitro
Терапевтический ген
Терапевтический

ген

Генная терапия

Слайд 21

Что надо для успеха?
Выбор потенциально терапевтического гена (моногенные заболевания, вирусные и

бактериальные инфекции)
Выбор вектора (адено-ассоциированные вирусы, аденовирусы, ретровирусы, включая лентивирусы)
Разработка средств доставки гена (нетравматические, адресные, предотвращение попадания в системный кровоток)

Слайд 22

Клинические испытания по генной терапии (2010 г.)

Слайд 23

Генная терапия некоторых заболеваний человека
Заболевание Вектор Ген
Болезнь Паркинсона RV декарбоксилаза глутаминовой

ы кислоты
Гемофилия AAV фактор IX
Грануломатоз RV GP91
Острый иммунодефицит RV рецептор интерлейкина 2
Дефицит орнитинтранскарбамилазы Ad cDNA OTC
Врождённый амавроз Лебера RV RPE65
Ишемия нижних конечностей Ad ангиогенин, VEGF

Слайд 24

Типы генов, используемых при генной терапии

Слайд 25

Слайд 26

Генная терапия опухолей с использованием клеток иммунной системы, нагруженных рекомбинантными онколитическими

вирусами

Вирусы

Клетки с вирусами

Опухоль

Вирус болезни Ньюкасла, рекомбинантные аденовирусы, реовирусы, вирус простого герпеса

Слайд 27

Принцип использования для терапии рака гена-убийцы (фермент тимидинкиназа вируса простого герпеса, HSV-tk)

Слайд 28

Направленное подавление работы гена в клетках достигается с помощью:
1) Антисмысловых

РНК
2) Рибозимов
3) РНК- и ДНК-аптамеров
4) Белковых аптамеров
5) РНК-интерференции
6) Нокаута гена

Слайд 29

SELEX (англ. systematic evolution of ligands by exponential enrichment – систематическая

эволюция лигандов при экспоненциальном обогащении)

Комбинаторная библиотека олигонуклеотидов
(1015)

Обогащенная фракция

Связывание

Несвязавшиеся молекулы (отбрасываются)

Связавшиеся молекулы

Элюция

ПЦР

Колонка с «пришитым» белком-мишенью

Несколько
циклов

Схема получения ДНК-аптамеров

Слайд 30

Слайд 31

белки семейства Aргонавт
Основные механизмы РНК-интерференции
Разрезание мРНК
Блокировка трансляции мРНК
Подавление транскрипции

за счет изменения структуры хроматина

Слайд 32

1990 г. – ген аденозиндезаминазы в аденовирусе (наследственный иммунодефицит) (Андерсон, США).
2003

г. – в Китае впервые разрешили применение препарата генной терапии (гендицин) для лечения эпидермоидного рака ( Гендицин - аденовирус содержащий ген p53 ).
2012 г. - Европейское медицинское агентство (ЕМА) впервые разрешило регистрацию на территории Евросоюза препарата, предназначенного для генной терапии моногенного заболевания - дефицита липопротеинлипазы (ААV и ген липопротеинлипазы).

Первые успехи генной терапии

Слайд 33

Перспективы генно-клеточной терапии
Стволовые нейрональные клетки, экспрессирующие VEGF, - при инсульте
Эмбриональные

стволовые клетки, экспрессиирующие VEGF и L1CAM, – при боковом амиотрофическом склерозе
Мезенхимные стволовые клетки, экспрессирующие сурвивин, - при инсульте
Гематопоэтические стволовые клетки, экспрессирующие аденозиндеаминазу, - при остром комбинированном иммунодефиците.
Редактирование ДНК с помощью CRISPR/Cas

Слайд 34

Таргетинг генов

Слайд 35

Гомологичная рекомбинация
Осуществляется через образование структуры Холидея.
В этом участвуют разнообразные ферменты: -

комплекс топоизомераз, - комплекс эндонуклеаз, - рекомбиназа, - резольваза.
Частота ГР составляет для разных участков хромосом от 10-3 до 10-7.

Слайд 36

Структура Холидея: двойной разрыв в гомологичных хромосомах

Слайд 37

Хронологическая справка об использовании механизма гомологичной рекомбинации

Слайд 38

Потомство, произошедшее из таргетированных ЭСК
Потомство,
произошедшее из клеток хозяйского эмбриона
Химера
Таргетинг гена

и селекция

Инъекция таргетированных ЭСК в хозяйский эмбрион

Перенос бластоцисты приемной матери

Получение бластоцисты

Выделение клеток внутренней клеточной массы

Культивирование ЭСК

Схема получения трансгенных мышей с таргетированным геном

Химера

Слайд 39

Два типа векторов используемых для гомологичной рекомбинации

Слайд 40

Нокаут селектируемого гена гипоксантинфосфорибозилтрансферазы (hprt)
Ген hprt
neo
Таргетирующий вектор

3 4 5 6 7 8 9

neo

Селекция: Hprt- - резистентность к 6-тиогуанину, Neo+ - резистентность к G418

Нокаут гена

Слайд 41

Позитивно-негативная селекция таргетированного неселектируемого гена
neo
tk

Слайд 42

Генный нокаут с использование для негативной селекции гена дефтерийного токсина
Промотор
Сайт полиаденилирования

Слайд 43

Кондиционный нокаут (система Cre-loxP бактериофага Р1)
Сайты loxP
Мышь №1
Мышь №2 с рекомбиназой

Cre

Таргетируемый ген

Геномная ДНК

Вектор

Слайд 44

Вектор 1
Вектор 2
Нокин гена (knock-in)
Мутация
+
+

Слайд 45

Функции генов, установленные с помощью их нокаута

Слайд 46

Выявление генов, препятствующих развитию лимфомогенеза, с помощью генного нокаута

Слайд 47

Синергизм между «классическими» трансгенами и нокаутированными генами в усилении развития лимфом

Слайд 48

Синергизм между действием генов в лимфомогенезе, установленный на основе анализа дважды

и трижды нокаутированных мышей

Слайд 49

Обнаружение генов, участвующих в раннем развитии, с помощью нокаута генов
Нокаутированный ген

Аномалии развития

Гамма-субъединица ламинина Остановка развития на стадии формирования экстраэмбриональной энтодермы из-за дефекта миграции клеток
Brachyury Ранняя гибель зародышей из-за блока развития мезодермы
GATA-4 Остановка развитие эндодермы
GATA-3 Гибель на 11-12 день гестации от блока гемапоэза в фетальной печени
SCL Гибель на 9.5 день из-за блока желточного кроветворения
Flt Блокирование развития желточного мешка
FGF-4 Остановка в развитии и гибель сразу после имплантации из-за блока развития клеток трофэктодермы

Слайд 50

Примеры изучения вирусного патогенеза с помощью нокаута генов
Вирус лейкоза мышей
Мыши дикого

типа – синдром иммунодефицита
Нокаут-мыши по гену интерлейкина 4 – синдрома нет.
Вывод: интерлейкин 4 способствует развитию иммунодефицита, вызываемого вирусом.

Вирус LDV

Мыши дикого типа – вирус-специфический иммунный ответ
Нокаут-мыши по гену гамма-интерферона 4 – сохранение вирус-специфического иммунного ответа.

Вывод: гамма-интерферон не участвует в формировании иммунного отввета.

Слайд 51

Слайд 52

Таргетинг генов без ЭСК – прямо в зиготе (редактирование генома)
2009 г. –

белки с «цинковыми пальцами»
2011 г. – бактериальные белки TALEN
2012 г. – CRISPR/Cas

Слайд 53

Редактирование генома на основе «цинковых пальцев»
Соединение негомологичных концов
Гомологичная рекомбинация
Активация

систем репарации

Слайд 54

Редактирование генома на основе TALENs
---------------------------------------------------------------------------------(Trascription Activator-like Effector Nucleases (TALENs) – белки

из бактерий рода Xanthomonas, соединенные с нуклеазой FokI).

Схема работы и области применения TAL-белков

AD-активирующий домен RD- репрессирующий домен

Слайд 55

Замена в белке RAB38 одной аминокислоты (глицина на валин)
мРНК TALEN + одноцепочечная

ДНК с мутацией

Внесение мутации chocolate в геном мыши дикого типа (a) и исправление мутантного фенотипа (b). мРНК TALEN вводят в одноклеточный эмбрион вместе с одноцепочечной ДНК, которая служит матрицей для рекомбинации. Нуклеаза вводит разрыв в одном из ядер (материнское или отцовское), разрыв репарируется путем рекомбинации с одноцепочечной ДНК. Полученная мышь является основателем мутантной линии Rab38cht, либо основателем «исправленной» линии (Rab38WT).

мРНК TALEN + одноцепочечная ДНК без мутации

Слайд 56

CRISPR (от англ. clustered regularly interspaced short palindromic repeats — короткие палиндромные — короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами —

особые локусы — короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами — особые локусы бактерий — короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами — особые локусы бактерий и архей — короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами — особые локусы бактерий и архей, состоящие из прямых повторяющихся последовательностей — короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами — особые локусы бактерий и архей, состоящие из прямых повторяющихся последовательностей, которые разделены уникальными последовательностями (спейсерами — короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами — особые локусы бактерий и архей, состоящие из прямых повторяющихся последовательностей, которые разделены уникальными последовательностями (спейсерами). Спейсеры заимствуются из чужеродных генетических элементов, с которыми сталкивалась клетка — короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами — особые локусы бактерий и архей, состоящие из прямых повторяющихся последовательностей, которые разделены уникальными последовательностями (спейсерами). Спейсеры заимствуются из чужеродных генетических элементов, с которыми сталкивалась клетка (бактериофагов — короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами — особые локусы бактерий и архей, состоящие из прямых повторяющихся последовательностей, которые разделены уникальными последовательностями (спейсерами). Спейсеры заимствуются из чужеродных генетических элементов, с которыми сталкивалась клетка (бактериофагов, плазмид).

Слайд 57

CRISPR/Cas9 для редактирования генома

Слайд 58

Редактирование гена бета-талассемии в эмбрионе человека

Слайд 59

Впервые в мире технологию CRISPR/Cas9 для модификации эмбрионов человека применили исследователи из Китая

в 2015 г.
Использовали 86 оплодотворенных яйцеклеток, из которых 71 выжила после процедуры. Cas9 нашел и внес разрыв в нужном месте ДНК только в половине случаев, при этом только в четырех случаях этот разрыв был успешно заменен «правильной» последовательностью.
Авторы статьи были удивлены низкой эффективностью процедуры, которая обычно хорошо работает на модели животных.

Слайд 60

Слайд 61

Слайд 62

Слайд 63

Экспрессия трансгенов

Содержание