Культивирование клеток млекопитающих 2021

Когда нужно культивировать клетки?

Исследование нормальной физиологии и биохимии клеток
Изучение свойств

План наших лекций

Оборудование
Среда культивирования клеток
Техники культивирования
Введение генетического материала в клетки
Контаминация в

ОБОРУДОВАНИЕ

Часть1

Что нужно для работы?

Соблюдение стерильности

Поддержание оптимальных условий

хранение

анализ

сбор материала

СO2 инкубаторы

Очень точное поддержание температуры
Контроль влажности
Создание газовой фазы с заданными свойствами

Типы CO2 инкубаторов

Ламинары

Это наше основное место обитания при работе с культурой клеток
Оборудованы всем

Правила работы в ламинаре

В ламинаре должен быть минимум предметов (часто это

https://youtu.be/yJ_acpKglto

Микроскопы

Инвертированные
Обязательно с фазовым контрастом
С цифровой камерой
Желательно иметь возможность работать с

Сосуды Дьюара

https://youtu.be/bkiKKRGJbjc

Длительное хранение образцов (до десятков лет!)
Транспортировка материала
Глубокая заморозка для последующей

Хранение в сосуде Дьюара

https://youtu.be/bkiKKRGJbjc

Среда для культивирования клеток

Что входит в состав среды для культивирования
Физико-химические

Немного истории

С.Рингер, 1882 – создание изотоничного раствора (поддерживал биение сердца лягушки)
30-40гг

Немного истории

M. T Burrows (1911) – выяснил, что для культуры ткани

Подходы в создании сред культивирования

Подход 1 (метод Фишера). Использование диализованной сыворотки,

Подход 2 ( Philip R. White) – полный отказ от сыворотки и

Поиск заменителей сыворотки и разработка сред для отдельных линий (1970- наст

Что обычно входит в состав среды для культивирования более 50 химических

sigma-aldrich.com

DMEM

Производные сред Игла

Ренато Дульбекко
1914-2012. Нобелевская премия (1975)

Гарри Игл
1905-1992

Норман Исков

pH среды Контролируется индикаторами (феноловый красный)

A- pH 6.5
B- pH 7.0
C- pH 7.4
D

Поддержание рН среды: CO2 и бикарбонат натрия

Альтернативные буферные системы:
-HEPES (до

Кислород
Требования к содержанию кислорода очень зависят от типа клеток
Многие культуры (СКК,

Другие факторы

Осмолярность
Плазма человека – 290 mosmol/kg. Культура клеток – 260-310

Сыворотка-это…

Ростовые факторы
Жирорастворимые витамины
Микроэлементы (селен, молибден, рубидий)
Ингибиторы (TGFb, белки системы комплемента)

В

Ростовые факторы в сыворотке

PDGF – тромбоцитарный фактор роста, основной фактор роста

Способы культивирования клеток
Пластик для культивирования
Техника пересева клеток

Техника культивирования клеток

Способы культивирования клеток

стационарное

суспензионное

Зависят от объема культуры и особенностей клеток

Суспензионные – просто посчитать и разбавить свежей средой
Полуприкрепленные– механически отделяют от

Визуально
Подсчет в камере Горяева
Электронные счетчики
Центрифугирование-взвешивание

Способы подсчета клеток

Подсчет в камере Горяева

Суспензия клеток должна быть тщательно перемешана
Камера должна быть

https://www.youtube.com/watch?v=pP0xERLUhyc

Подсчет с помощью автоматических счетчиков

Быстрый подсчет десятков образцов
Определение размера клеток
Высокая точность

Vi-Cell

Клетки HEK293

Преимущества HEK293 и их производных

Неприхотливы, хорошо растут в простых средах, в

Expi293 Expression System kit

Богатая среда, универсальная и для роста и трансфекции
Клетки

Клетки Expi293

Expifectamine 293

Состав наборов (китов) часто закрыт. Информация частично доступна из патентов

Высокоэффективный вектор

CMV- human cytomegalovirus immediate-early enhancer and promoter

WPRE- Woodchuck Hepatitis Virus (WHP)

ВВЕДЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА В КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

Трансфекция клеток Трансфекция – введение

Почему происходит трансфекция?

Кальций-фосфатная трансфекция

В присутствии солей кальция ДНК выпадает в осадок
Эффективность процесса зависит

Липосомный метод трансфекции

Электропорация

Продолжительности импульса
Напряженности электрического поля
Формы кривой импульса
Числа импульсов
Концентрации клеток и плазмиды

Зависит от…

Как выбрать метод трансфекции

E=n/N*100, где n-число ЖИВЫХ клеток, получивших плазмиду, N-общее число ЖИВЫХ клеток
Для

http://www.exonbio.com/vector_construction.php

http://blog.addgene.org/topic/plasmids-101

http://www.thermofisher.com

Примеры экспрессионных векторов

Гены позитивной селекции

КОНТАМИНАЦИЯ В КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУРАХ

Контаминация клеточных культур

Типы контаминации
Источники
Методы предотвращения
«Лечение» клеточных культур

Типы контаминации

Почему опасна контаминация?

«Отравление» клеточной культуры бактериальными токсинами
Метаболиты аргинина и пуриновых оснований

Источники контаминации

Особенности разных видов контаминации

Методы предотвращения контаминации

Только сыворотка от надежного производителя!
Регулярные профилактические работы: обработка инкубатора

Микоплазма A conservative estimate states that between 15-35% of all continuous cell

Проблемы, связанные с присутствием микоплазмы в клеточных культурах

ОСНОВЫ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ

https://www.youtube.com/watch?v=EQXPJ7eeesQ

B2-R0-V4-Y4