Метод Дригальского. Этапы выделения чистой культуры и ее идентификации

Август 4, 2022

Главная
Биология
Метод Дригальского. Этапы выделения чистой культуры и ее идентификации

Содержание

2. Выделение чистой культуры бактерий – обязательный этап бактериологичекого исследования в лабораторной диагностике. Метод Дригальского основан на
3. Метод Дригальского 1-й этап. Рассев исследуемого материала по поверхности плотной питательной среды с целью получения изолированных
4. 1-й этап. Посевы «газоном» производят на плотную питательную среду в чашке Петри. Для этого, приоткрыв левой
5. Техника посева
6. 2-й этап. Макро- и микроскопическое изучение выросших колоний и отсев колонии, характерной для определенного вида на
7. По результатам посева серийных разведений исследуемого материала выбирают чашку Петри, удобную для подсчета колоний. Подсчет колоний
8. Культуральные свойства бактерий. Характер роста на жидких и плотных питательных средах. Влияние кислорода на рост культуры
9. Культуральные свойства бактерий Колонии различаются по величине, форме, цвету, консистенции, контуру края, структуре и характеру поверхности:
10. Культуральные свойства бактерий (продолжение) Streptomyces Рост изолированных колоний Klebsiella pneumoniae
11. S.аureus на кровяном агаре Колонии Bacillus anthracis «голова медузы» Колонии возбудителя чумы Y.pestis «кружевной платочек» Культуральные
12. Культуральные свойства бактерий. Пигменты. Рост чистой культуры Micrococcus roseus. Рост чистой культуры S. aureus
13. Культуральные свойства бактерий. Температурные границы роста. ПСИХРОФИЛЫ – оптимум от 0 до 200С - Vibrio marinus
14. Температурные интервалы роста бактерий. Температура влияет на скорости ферментативных реакций, состояние мембран и поддержание конформации белков
15. Влияние рН питательной среды на рост культуры бактерий. Подавляющее большинство микроорганизмов хорошо растёт при нейтральном рН
16. Метод Дригальского 3-й этап. Задача 3 этапа – идентификация- определение вида – выделенной чистой культуры по
17. Микроскопия может предоставить лишь информацию о форме бактерий и их расположении в мазке, типе клеточной стенки
18. Видовая идентификация 1. Биохимическая идентификация Биохимическая идентификация выделенной чистой культуры заключается в определении спектра ее ферментативной
19. Пример определения ферментативной активности на тест-системах api Тест-система с сухими дифференциально-диагностическими средами заполняется суспензией из чистой
20. Вид системы для энтеробактерий после инкубации. Верхний планшет – все тесты положительны, нижний – все отрицательны.
22. ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ НЕКОТОРЫХ РОДОВ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ.
23. Рапид-системы для биохимической идентификации Используют хромогенные субстраты, которые дают окрашенные продукты при их расщеплении бактериальными ферментами
24. Автоматические системы биохимической идентификации Система, подобная МикроТакс, включает ридер МТ-1 - 8-канальный фотометр для считывания планшет
25. Методы, используемые для внутривидовой идентификации бактерий 2. Рестрикционный анализ основан на применении ферментов рестриктаз - эндонуклеазы,
26. Методы, используемые для внутривидовой идентификации бактерий 3. Определение плазмидного профиля бактерий. Для этого из бактериальной клетки
27. Методы, используемые для внутривидовой идентификации бактерий 4. Риботипирование. Последовательность нуклеотидных оснований в оперонах, кодирующих рРНК, характеризуется
28. Методы, используемые для внутривидовой идентификации бактерий 4. Риботипирование. Фрагменты ДНК, полученные после обработки ее рестриктазами, содержат
30. Видовая идентификация 5. Секвенирование гена 16S рРНК - использует данные о нуклеотидных последовательностях выделенных чистых культур.
31. Прочтение последовательности, как правило, осуществляется с помощью постановки полимеразной цепной реакции с праймерами под ген 16S
32. Метод секвенирования гена 16S рРНК является «золотым стандартом» точности видовой идентификации бактерий, обладает наибольшей воспроизводимостью, применим
33. Видовая идентификация. 6.MALDI-ToF масс-спектрометрия MALDI (Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация) – способ ионизации вещества, использующийся при масс-спектрометрии. Относится
35. Скачать презентацию

Слайд 2

Выделение чистой культуры бактерий – обязательный этап бактериологичекого исследования в лабораторной

диагностике.
Метод Дригальского основан на механическом разобщении клеток.

Слайд 3

Метод Дригальского
1-й этап.
Рассев исследуемого материала по поверхности плотной питательной среды

с целью получения изолированных колоний.
Может включать предварительную микроскопию исследуемого материала

Слайд 4

1-й этап.
Посевы «газоном» производят на плотную питательную среду в чашке Петри.

Для этого, приоткрыв левой рукой крышку, петлёй или пипеткой наносят посевной материал на поверхность питательного агара по методу Дригальского.

Техника посева

Слайд 5

Техника посева

Слайд 6

2-й этап.
Макро- и микроскопическое изучение выросших колоний и отсев колонии, характерной

для определенного вида на скошенный агар или чашку Петри со свежим агаром для получения чистой культуры.

Слайд 7

По результатам посева серийных разведений исследуемого материала выбирают чашку Петри, удобную

для подсчета колоний.

Подсчет колоний

Слайд 8

Культуральные свойства бактерий.
Характер роста на жидких и плотных питательных средах.
Влияние

кислорода на рост культуры бактерий.
Температурные границы роста культуры бактерий.
Влияние рН питательной среды на рост культуры бактерий.

Слайд 9

Культуральные свойства бактерий
Колонии различаются по величине, форме, цвету, консистенции, контуру

края, структуре и характеру поверхности:
по величине — крупные (диаметр более 4—5 мм), средние (2—4 мм) и малые (1—2 мм)
по форме — круглые, розеткообразные, листовидные и т. д.
по цвету, зависящему от пигмента — белого, ярко-синего, красного цветов и т. д.
по консистенции — сухие, влажные, сочные, слизистые
по поверхности — гладкие, морщинистые, исчерченные, плоские, выпуклые, плосковыпуклые, вдавленные
по краю — с ровными, волнистыми, бахромчатыми краями
по структуре — могут иметь аморфную, зернистую, волокнистую внутреннюю структуру
в чистой культуре, выращенной на скошенном питательном агаре, характер роста может быть сухим, влажным, ползучим, складчатым, пигментированным

Слайд 10

Культуральные свойства бактерий (продолжение)
Streptomyces
Рост изолированных колоний
Klebsiella pneumoniae

Слайд 11

S.аureus на кровяном агаре
Колонии Bacillus anthracis
«голова медузы»
Колонии возбудителя чумы Y.pestis
«кружевной

платочек»

Культуральные свойства бактерий (продолжение)

Слайд 12

Культуральные свойства бактерий. Пигменты.
Рост чистой культуры Micrococcus roseus.
Рост чистой культуры

S. aureus

Слайд 13

Культуральные свойства бактерий. Температурные границы роста.
ПСИХРОФИЛЫ – оптимум от 0

до 200С
- Vibrio marinus
- Pseudomonas fluorescens
- Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis (от 4 до 400С)- факультативные психрофилы
МЕЗОФИЛЫ - оптимум 30 - 40⁰С (от 10 до 45оС)
ТЕРМОФИЛЫ - оптимум 45 - 65⁰С
- Bacillus stearotermophilus
- Thermoactinomyces vulgaris

Слайд 14

Температурные интервалы роста бактерий.
Температура влияет на скорости ферментативных реакций,

состояние мембран и поддержание конформации белков и нуклеиновых кислот.
Для некоторых патогенных микроорганизмов повышение температуры является сигналом о попадании в организм человека, влияя на синтез их факторов патогенности.

Слайд 15

Влияние рН питательной среды на рост культуры бактерий.
Подавляющее большинство микроорганизмов хорошо

растёт при нейтральном рН – нейтрофилы
Актиномицеты и бактерии, разлагающие мочевину, предпочитают среды с более высоким рН - алкалифилы (Vibrio cholerae)
Некоторые бактерии (например, M.tuberculosis, лактобациллы) и грибы толерантны к кислой среде - ацидофилы

Слайд 16

Метод Дригальского 3-й этап.
Задача 3 этапа – идентификация- определение

вида – выделенной чистой культуры по комплексу биологических свойств:
Морфологических
Тинкториальных
Культуральных
Биохимических
Антигенных
Токсигенных
Чувствительности к антибиотикам и др. лекарственным препаратам
Чувствительности к типовым диагностическим фагам

Слайд 17

Микроскопия может предоставить лишь информацию о форме бактерий и их расположении

в мазке, типе клеточной стенки и способности к спорообразованию, что явно недостаточно для различения десятков тысяч видов микроорганизмов.
Дополнительную информацию может предоставить учет культуральных свойств – характера роста микроорганизмов на питательных средах. Современные дифференциально-диагностические среды, сочетающие различные хромогенные субстраты и индикаторы, позволяют на этапе первичного посева из исследуемого материала определять по культуральным свойствам отдельные наиболее значимые таксономические группы. Однако, они также не способны решить задачу определения вида для произвольной выделенной чистой культуры.
Полноценная видовая идентификация может производиться с использованием различных подходов. Некоторые из них применяются только в пределах отдельной таксономической группы – например, идентификация по антигенным свойствам для представителей рода Streptococcus. Но некоторые из подходов возможно использовать и для видовой идентификации широкого круга микроорганизмов:

Слайд 18

Видовая идентификация 1. Биохимическая идентификация
Биохимическая идентификация выделенной чистой культуры заключается
в определении

спектра ее ферментативной активности,
способности к сбраживанию определенных субстратов
или синтез тех или иных конечных продуктов.

Слайд 19

Пример определения ферментативной активности на тест-системах api
Тест-система с сухими дифференциально-диагностическими средами

заполняется суспензией из чистой культуры бактерий и инкубируется в термостате

Слайд 20

Вид системы для энтеробактерий после инкубации. Верхний планшет – все тесты

положительны, нижний – все отрицательны.

Вид системы для стафилококков после инкубации. Верхний планшет – все тесты положительны, нижний – все отрицательны.
Через 18-24 часа проводится учёт цвета лунок и соотнесение полученных результатов с базой данных, которая может представлять собой как книгу, так и компьютерную программу

Слайд 21

Слайд 22

ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ НЕКОТОРЫХ РОДОВ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ.

Слайд 23

Рапид-системы для биохимической идентификации
Используют хромогенные субстраты, которые дают окрашенные продукты при

их расщеплении бактериальными ферментами

Как и при использовании классических дифференциально-диагностических сред лунки заполняют суспензией бактерий
Результат учитывают через 4 часа

Слайд 24

Автоматические системы биохимической идентификации
Система, подобная МикроТакс, включает
ридер МТ-1 - 8-канальный фотометр

для считывания планшет со встроенным шейкером и жидкокристаллическим дисплеем
инкубатор МТ-5 (внутренняя камера которого выполнена из нержавеющей стали) с жидкокристаллическим дисплеем
автоматическая 8-канальная электронная пипетка с зарядным устройством;
управляющий блок на базе персонального компьютера с программным обеспечением и принтером.

Анализатор для идентификации микроорганизмов и определения чувствительности к антибиотикам VITEK 2 Compact 30

Слайд 25

Методы, используемые для внутривидовой идентификации бактерий
2. Рестрикционный анализ основан на применении

ферментов рестриктаз - эндонуклеазы, которые расщепляют молекулы ДНК, разрывая фосфатные связи в определенных последовательностях нуклеотидов.
В геноме конкретной таксономической единицы находится строго определенное (генетически задетерминированное) число участков узнавания для определенной рестриктазы.
Если выделенную из конкретного микроба ДНК обработать определенной рестриктазой, то это приведет к образованию строго определенного количества фрагментов ДНК фиксированного размера.
Размер каждого типа фрагментов можно узнать с помощью электрофореза в агарозном геле

Гель окрашивают бромистым этидием и фотографируют в УФ-излучении.
Таким способом можно получить рестрикционную карту определенного вида микробов

Слайд 26

Методы, используемые для внутривидовой идентификации бактерий
3. Определение плазмидного профиля бактерий.
Для

этого из бактериальной клетки выделяют плазмидную ДНК, которую разделяют электрофорезом в агарозном геле для определения количества и размеров плазмид.

Слайд 27

Методы, используемые для внутривидовой идентификации бактерий
4. Риботипирование.
Последовательность нуклеотидных оснований в оперонах,

кодирующих рРНК, характеризуется наличием как консервативных участков, которые подверглись малым изменениям в процессе эволюции и имеют сходное строения у различных бактерий, так и вариабельных последовательностей, которые родо- и видо-специфичны и являются маркерами при генетической идентификации.
Эти опероны представлены на бактериальной хромосоме в нескольких копиях.

Слайд 28

Методы, используемые для внутривидовой идентификации бактерий
4. Риботипирование.
Фрагменты ДНК, полученные после обработки

ее рестриктазами, содержат последовательности генов рРНК, которые могут быть обнаружены методом молекулярной гибридизации с меченой рРНК соответствующего вида бактерий.
Количество и локализация копий оперонов рРНК и рестрикционный состав сайтов как внутри рРНК-оперона, так и по его флангам варьируют у различных видов бактерий.
На основе этого свойства построен метод риботипирования, который позволяет производить мониторинг выделенных штаммов и определение их вида.
В настоящее время риботипирование проводится в автоматическом режиме в специальных приборах.

ПДРФ – полиморфизм длины рестрикционных фрагментов

Слайд 29

Слайд 30

Видовая идентификация 5. Секвенирование гена 16S рРНК
- использует данные о

нуклеотидных последовательностях выделенных чистых культур.
Ген 16S рРНК выбран как универсальный маркер для видовой идентификации: он имеется в геномах всех прокариот и обладает сравнительно малой изменчивостью.
В большинстве случаев применимо следующее правило: совпадение у двух штаммов последовательностей этого гена на 97% и более свидетельствует, что они относятся к одному виду, в противном случае – к разным.
На сегодняшний день обязательным требованием для описания нового вида прокариот является публикация последовательности гена 16S рРНК в открытом доступе.

Слайд 31

Прочтение последовательности, как правило, осуществляется с помощью постановки полимеразной цепной реакции

с праймерами под ген 16S рРНК с последующей очисткой ДНК и секвенированием по Сэнгеру (детально данные методы будут детально рассмотрены в разделе «Генетика бактерий»).
Далее последовательность сравнивается с компьютерной базой данных с использованием алгоритма BLAST (англ. Basic Local Alignment Search Tool - средство поиска основного локального выравнивания).

Слайд 32

Метод секвенирования гена 16S рРНК является «золотым стандартом» точности видовой идентификации

бактерий, обладает наибольшей воспроизводимостью, применим к прокариотам любых таксономических групп.
Из недостатков необходимо отметить сравнительную трудоемкость и длительность данного подхода, а также требование специализированной аппаратуры для полимеразной цепной реакции и секвенирования.

Слайд 33

Видовая идентификация. 6.MALDI-ToF масс-спектрометрия
MALDI (Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация) – способ ионизации вещества, использующийся

при масс-спектрометрии. Относится к т.н. «мягким» способам ионизации, позволяющим ионизировать крупные биомолекулы без их деградации.
В основе метода лежит использование вспомогательного вещества - «матрицы», свойства которого обуславливают понижение деструктивных свойств лазерного излучения и ионизацию анализируемого вещества.
TOF (Time of Flight - вреямпролетный) – принцип устройства анализатора масс-спектрометра, в котором заряженные частицы разделяются по времени пролета определенного расстояния. При этом время пролета частицы пропорционально отношению массы данной частицы к ее заряду.

MALDI – матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация

Метод Дригальского. Этапы выделения чистой культуры и ее идентификации

Содержание

Выделение чистой культуры бактерий – обязательный этап бактериологичекого исследования в лабораторной

Метод Дригальского1-й этап. Рассев исследуемого материала по поверхности плотной питательной среды

1-й этап. Посевы «газоном» производят на плотную питательную среду в чашке Петри.

Техника посева

2-й этап. Макро- и микроскопическое изучение выросших колоний и отсев колонии, характерной

По результатам посева серийных разведений исследуемого материала выбирают чашку Петри, удобную

Культуральные свойства бактерий.Характер роста на жидких и плотных питательных средах.Влияние

Культуральные свойства бактерий Колонии различаются по величине, форме, цвету, консистенции, контуру

Культуральные свойства бактерий (продолжение) StreptomycesРост изолированных колонийKlebsiella pneumoniae

S.аureus на кровяном агареКолонии Bacillus anthracis«голова медузы» Колонии возбудителя чумы Y.pestis«кружевной

Культуральные свойства бактерий. Пигменты.Рост чистой культуры Micrococcus roseus. Рост чистой культуры

Культуральные свойства бактерий. Температурные границы роста.ПСИХРОФИЛЫ – оптимум от 0

Температурные интервалы роста бактерий. Температура влияет на скорости ферментативных реакций,

Влияние рН питательной среды на рост культуры бактерий. Подавляющее большинство микроорганизмов хорошо

Метод Дригальского 3-й этап. Задача 3 этапа – идентификация- определение

Микроскопия может предоставить лишь информацию о форме бактерий и их расположении

Видовая идентификация 1. Биохимическая идентификацияБиохимическая идентификация выделенной чистой культуры заключается в определении

Пример определения ферментативной активности на тест-системах apiТест-система с сухими дифференциально-диагностическими средами

Вид системы для энтеробактерий после инкубации. Верхний планшет – все тесты

ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ НЕКОТОРЫХ РОДОВ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ.

Рапид-системы для биохимической идентификацииИспользуют хромогенные субстраты, которые дают окрашенные продукты при

Автоматические системы биохимической идентификацииСистема, подобная МикроТакс, включаетридер МТ-1 - 8-канальный фотометр

Методы, используемые для внутривидовой идентификации бактерий2. Рестрикционный анализ основан на применении

Методы, используемые для внутривидовой идентификации бактерий3. Определение плазмидного профиля бактерий. Для

Методы, используемые для внутривидовой идентификации бактерий4. Риботипирование. Последовательность нуклеотидных оснований в оперонах,

Методы, используемые для внутривидовой идентификации бактерий4. Риботипирование. Фрагменты ДНК, полученные после обработки

Видовая идентификация 5. Секвенирование гена 16S рРНК - использует данные о

Прочтение последовательности, как правило, осуществляется с помощью постановки полимеразной цепной реакции

Метод секвенирования гена 16S рРНК является «золотым стандартом» точности видовой идентификации

Видовая идентификация. 6.MALDI-ToF масс-спектрометрияMALDI (Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация) – способ ионизации вещества, использующийся

Похожие презентации

Метод Дригальского
1-й этап.
Рассев исследуемого материала по поверхности плотной питательной среды

1-й этап.
Посевы «газоном» производят на плотную питательную среду в чашке Петри.

2-й этап.
Макро- и микроскопическое изучение выросших колоний и отсев колонии, характерной

Культуральные свойства бактерий.
Характер роста на жидких и плотных питательных средах.
Влияние

Культуральные свойства бактерий
Колонии различаются по величине, форме, цвету, консистенции, контуру

Культуральные свойства бактерий (продолжение)
Streptomyces
Рост изолированных колоний
Klebsiella pneumoniae

S.аureus на кровяном агаре
Колонии Bacillus anthracis
«голова медузы»
Колонии возбудителя чумы Y.pestis
«кружевной

Культуральные свойства бактерий. Пигменты.
Рост чистой культуры Micrococcus roseus.
Рост чистой культуры

Культуральные свойства бактерий. Температурные границы роста.
ПСИХРОФИЛЫ – оптимум от 0

Температурные интервалы роста бактерий.
Температура влияет на скорости ферментативных реакций,

Влияние рН питательной среды на рост культуры бактерий.
Подавляющее большинство микроорганизмов хорошо

Метод Дригальского 3-й этап.
Задача 3 этапа – идентификация- определение

Видовая идентификация 1. Биохимическая идентификация
Биохимическая идентификация выделенной чистой культуры заключается
в определении

Пример определения ферментативной активности на тест-системах api
Тест-система с сухими дифференциально-диагностическими средами

Рапид-системы для биохимической идентификации
Используют хромогенные субстраты, которые дают окрашенные продукты при

Автоматические системы биохимической идентификации
Система, подобная МикроТакс, включает
ридер МТ-1 - 8-канальный фотометр

Методы, используемые для внутривидовой идентификации бактерий
2. Рестрикционный анализ основан на применении

Методы, используемые для внутривидовой идентификации бактерий
3. Определение плазмидного профиля бактерий.
Для

Методы, используемые для внутривидовой идентификации бактерий
4. Риботипирование.
Последовательность нуклеотидных оснований в оперонах,

Методы, используемые для внутривидовой идентификации бактерий
4. Риботипирование.
Фрагменты ДНК, полученные после обработки

Видовая идентификация 5. Секвенирование гена 16S рРНК
- использует данные о

Видовая идентификация. 6.MALDI-ToF масс-спектрометрия
MALDI (Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация) – способ ионизации вещества, использующийся