Люминесценция. Типы люминесценции

Содержание

Слайд 2

Люминесценция (англ. luminescence) – - свечение. Термин введен Видеманом в 1889 году.

Люминесценция (англ. luminescence) –
- свечение.
Термин введен Видеманом в

1889 году.
Слайд 3

Выдающуюся роль в разви-тии учения о люминесцен-ции сыграла советская школа физиков,

Выдающуюся роль в разви-тии учения о люминесцен-ции сыграла советская школа физиков,

созданная С.И. Вавиловым (президент
АН СССР 1945 – 1951).
Вавилов и его ученики изучали этот вопрос с начала 20-х годов прошлого века, практически до конца жизни Сергея Ивановича.
Был решен ряд принципи-альных вопросов о природе этого явления и применения люминесценции в науке и практике.

Сергей Иванович Вавилов
1891-1951

Слайд 4

Типы люминесценции ФОТОЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ свечение под влиянием света (УФ- и видимого) Флуоресценция

Типы люминесценции

ФОТОЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ
свечение под влиянием
света (УФ- и видимого)

Флуоресценция
τ =

10-9 - 10-6 с

Фосфоресценция
τ = 10-3 - 10-1 с

ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ
свечение, использует
энергию хим. реакций

БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ
способность живых организмов
светиться, достигаемая само-
стоятельно или с помощью
симбионтов.

Слайд 5

Другие типы люминесценции РАДИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ - при возбуждении веще- ства ионизирующим излучением.

Другие типы люминесценции

РАДИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ - при возбуждении веще-
ства ионизирующим
излучением.

ЭЛЕКТРОЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ -

возникает при про-
пускании электрического тока через
определённые типы люминофоров.

ТЕРМОЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ - свечение, возникающее
в процессе нагревания вещества.
Синоним: Термостимулированная
люминесценция.

КАТОДОЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ - вызвана облучением
быстрыми электронами (катодными
лучами).

Слайд 6

ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ Многие химические реакции протекают с выделе-нием энергии в форме тепла

ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ

Многие химические реакции протекают с выделе-нием энергии в форме тепла

(экзотермические реак-ции).
Существуют химические реакции, протекающие с излучением света.
Хемилюминесценция (ХЛ) - свечение, сопровождаю-
щее химические реакции.
Большинство биохимических реакций сопровожда-
ются сверхслабым свечением («сверхслабое све-чение» или «собственное изучение» клеток и тканей).
Слайд 7

ХЛ в биосистемах - биохемилюминесценция Некоторые организмы излучают сравнительно яркий свет,

ХЛ в биосистемах - биохемилюминесценция
Некоторые организмы излучают сравнительно


яркий свет, хорошо видимый невооруженным гла-
зом - биолюминесценция

БИОХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ

Собственная ХЛ

Активированная ХЛ

Биолюминесценция

Классификация ХЛ в биосистемах

Слайд 8

В основе био-ХЛ (собственного или сверхслабого свечения) лежат реакции взаимодействия между

В основе био-ХЛ (собственного или сверхслабого
свечения) лежат реакции взаимодействия

между
свободными радикалами (СР): радикалами липидов,
радикалами кислорода и радикалами оксида азота.
А.Г.Гурвич (1934 г.) первым обнаружил собственное
свечение клеток - «митогенетические лучи».
Слайд 9

Механизм превращения энергии хим. реакции в световое излучение на примере рекомбинации

Механизм превращения энергии хим. реакции в световое излучение на примере

рекомбинации органических радикалов, получаемых с помощью электрохимической реакции (по Ю.А. Владимирову)

Раствор полициклических углеводородов (пирен,
антрацен и др.), способных к люминесценции

катод

анод

Электролиз – способ получения анион-радикалов и катион-радикалов
молекул углеводорода (запасание энергии в системе)

Слайд 10

Образование радикалов: с катода на нейтральную молекулу переходят электроны, образуя анион-ради-кал

Образование радикалов: с катода на нейтральную молекулу переходят электроны, образуя

анион-ради-кал (q-); на аноде нейтральная молекула отдаёт электрон, образуя катион-радикал (q+).
Образовавшиеся в системе ион-радикалы взаимо-действуют, при этом образуется две исходных молекулы углеводорода, но одна из этих молекул оказывается в электронно-возбужденном состоянии. Её возврат из возбужденного состояния в основное состояние сопровождается свечением (испусканием светового кванта).

2

1

2

_

+

+

2

2


+

+

1

возб. сост.

нейтр. мол.

а-радикал

к-радикал

Слайд 11

Собственная (слабая) ХЛ клеток и тканей Реакции с участием АФК Реакции СРО липидов Реакции NO

Собственная (слабая) ХЛ
клеток и тканей

Реакции с участием
АФК

Реакции СРО липидов

Реакции NO

Слайд 12

I тип реакций: Собственное свечение клеток и тканей с участием активных

I тип реакций:
Собственное свечение клеток и тканей с участием


активных форм кислорода
Активные формы кислорода (АФК):
перекись водорода (Н2О2 ? H-O-O*)
супероксидный анион-радикал кислорода (*О2-)
радикал гидроксила (НО*)
гипохлорит (ClO-)
Значимыми источниками АФК в организме – клетки-
макрофаги (гранулоциты и моноциты крови, а также
тканевые макрофаги). АФК, выделяемые активирован-
ными макрофагами внутрь фагоцитозной везикулы (фагосомы), служат цитотоксическими факторами, убивающими патогенные микроорганизмы.
Слайд 13

В мембранах макрофагов содержится НАДФН-ок-сидазный комплекс, с помощью которого НАДФН окисляется

В мембранах макрофагов содержится НАДФН-ок-сидазный комплекс, с помощью которого НАДФН


окисляется в результате восстановления двух моле-
кул кислорода до *О2-:
НАДФН + 2О2 ? НАДФ+ + 2*О2-
Супероксидные радикалы кислорода рекомбини-руют между собой с образованием Н2О2:
*О2- + *О2- ? H2O2 + O2
Макрофаги выделяют наружу миелопероксидазу, которая катализирует образование гипохлорита:
Н2О2 + Cl- ? H2O + ClO-
Слайд 14

В присутствие ионов железа (металл с переменой валентностью) образуется НО*: из

В присутствие ионов железа (металл с переменой
валентностью) образуется НО*:


из Н2О2 в реакции Фентона:
H2O2 + Fe2+ ? Fe3+ + HO- + HO*
из гипохлорита в реакции Осипова:
ClO- + Fe2+ ? Fe3+ + Cl- + HO*
Собственное свечение активированных фагоцитов
было открыто в 1971 году Р. Элланом.
Слайд 15

Полагают, что свечение обусловлено образовани- ем синглетного кислорода (1О2 – одна

Полагают, что свечение обусловлено образовани-
ем синглетного кислорода (1О2 – одна

из форм воз-
бужденного состояния кислорода) в реакции:
ClO- + H2O2 ? Cl- + H2O + 1O2
1. Синглетный кислород переходит в основное (триплетное) состояние с испусканием кванта света в ИК-области:
1O2 ? 3O2 + hν (λ = 1270 нм)
2. Синглетный кислород способен также образовы-вать димеры (эксимеры), которые переходят в основное состояние с испусканием квантов с λ = 635, 580 и 535 нм (видимая область спектра).
Слайд 16

II тип реакций: Собственное свечение клеток и тканей с участием цепного

II тип реакций:
Собственное свечение клеток и тканей с участием


цепного свободнорадикального/перекисного окисле-ния липидов (СРО липидов, ПОЛ)
СРО липидов постоянно (с разной интенсивностью) протекает в биомембранах и ЛП крови. Эти реакции идут с участием СР липидов (L*) и СР гидроперекисей липидов (LOO*):
LH
HO* + LH L* + O2 LOO* L* ?…..?
H2O LOOH
инициирование цепи продолжение цепи
Слайд 17

Образование гидроперекиси ПНЖК и её радикала PUFA – PolyUnsaturated Fatty Acid

Образование гидроперекиси ПНЖК и её радикала

PUFA – PolyUnsaturated Fatty Acid =

ПНЖК

диеновый конъюгат

L-O-O*

L-O-O-H

L*

радикал липида

радикал гидроперекиси
липида

гидроперекись
липида

Слайд 18

LOO* - СР, которые ведут цепь СРО липида. Их взаи-модействие приводит

LOO* - СР, которые ведут цепь СРО липида. Их взаи-модействие

приводит к образованию продуктов, которые находятся в электронно-возбужденном состо-янии:
LOO* + LOO* ? LOH + LO* + 1O2
Их переход (LO* и 1O2) в основное состояние сопро-вождается испусканием света:
LO* ? LO + hν1 (λ = 420 – 520 нм)
1O2 ? 3O2 + hν2 (λ = 1270 нм)
Вещества, взаимодействующие со СР и уничтожаю-щие их – АНТИОКСИДАНТЫ (АО). АО подавляют свечение, обусловленное реакциями СРО.
Слайд 19

III тип реакций: Собственное свечение клеток и тканей с участием оксида

III тип реакций:
Собственное свечение клеток и тканей с участием

оксида азота (NO)
Оксид азота – СР (*NO). Синтезируется с участием
фермента NO-синтазы из L-аргинина. NO выполняет
функцию вазодилататора.
В клетках возможна также реакция:
*NO + *O2- ? ONOO (пероксинитрит)
Роль этой реакции в собственном свечении клеток
и тканей показана в 1984 году Терренсом.
Свечение происходит при взаимодействии
пероксинитрита с белками.
Слайд 20

Причины чрезвычайно низкой интенсивности собственной ХЛ клеток и тканей («сверхслабое свечение»)

Причины чрезвычайно низкой интенсивности
собственной ХЛ клеток и тканей
(«сверхслабое свечение»)

1. [СР] в биологических системах сравнительно мала, поскольку СР – высокореактивные соедине-ния. В результате - невысоки скорости тех реакций, в ходе которых происходит свечение.
2. Не в 100% случаев взаимодействия СР образу-ются электронно-возбужденные молекулы продук-тов реакции.
3. Нет 100% вероятности того, что электронно-возбужденная молекула отдаст избыток энергии в форме светового кванта. Эта энергия может просто рассеяться в форме тепла.
Слайд 21

Прибор, с помощью которого регистрируют собствен- ную ХЛ клеток и тканей

Прибор, с помощью которого регистрируют собствен-
ную ХЛ клеток и тканей

– ХЕМИЛЮМИНОМЕТР.

ПРЕОБРАЗОВАТЕЛЬ СИГНАЛА

ФЭУ – фотоэлектронный умножитель

Слайд 22

Что измеряем с помощью хемилюминометра? Главные участники реакций, лежащих в основе

Что измеряем с помощью хемилюминометра?
Главные участники реакций, лежащих в основе

ХЛ
клеток и тканей – СР. Их концентрация в биоматери-
але чрезвчайно низка, а время жизни – доли секунды
(как результат высокой химической активности). Это
исключает применение методов химического анализа
для определения [CP].
Измерение интенсивности ХЛ (JХЛ) с помощью хе-
милюминометра – позволяет хоть и косвенно (мы не
считаем количество СР), но с высокой точностью су-
дить об активности реакций с участием СР в биома-
териале. Между JХЛ и [СР] существует прямая зави-
симость.
Слайд 23

Интенсивность ХЛ при СРО липидов равна скорости образования фотонов (квантов светового

Интенсивность ХЛ при СРО липидов равна скорости образования фотонов (квантов

светового излучения) в реакции:
LOO* + LOO* ? продукты реакции + hν (фотон)
По закону действующих масс, скорость реакции (моль
продукта / сек) можно представить как:
V = k [LOO*]2 где k – константа скорости
Тогда, интенсивность ХЛ (JХЛ, фотоны / сек) можно выразить:
JХЛ = QХЛ х k x [LOO*]
к-во квантов (фотонов)
где QХЛ – квантовый выход ХЛ; QХЛ =
к-во возбужд. молекул
Слайд 24

Т.о., интенсивность свечения (интенсивность ХЛ) отражает [СР], которые ведут (продолжают) цепи

Т.о., интенсивность свечения (интенсивность ХЛ)
отражает [СР], которые ведут (продолжают)

цепи
реакций ПОЛ, в каждый момент времени.
Это даёт ценную информацию для анализа механиз-
мов реакций на основе измерения кинетики ХЛ.
Слайд 25

Для чего используют измерение собственной (неактивированной) ХЛ Изучение фундаментальных механизмов проте-кания

Для чего используют измерение
собственной (неактивированной) ХЛ
Изучение фундаментальных механизмов проте-кания реакций

ПОЛ в живых системах, их регуляции и механизмов действия АО различной природы: Антиперекисные АО – разрушают уже образовав-шиеся органические гидроперекиси и
Антирадикальные АО или «ловушки» СР – уничто-жают СР).
Слайд 26

2. Показатель активности процессов СРО липидов в тканях организма (сыворотка, плазма

2. Показатель активности процессов СРО липидов
в тканях организма (сыворотка, плазма

и клетки крови)
при патологии .
Установлено, что амплитуда вспышки ХЛ, вызванной
добавлением к биоматериалу инициаторов реакций
СРО (ионы Fe2+), положительно коррелирует с кон-
центрацией продуктов СРО в образце и отрицательно
коррелирует с содержанием молекул, тормозящих эти
реакции – антиоксидантов (АО).
Данные такого исследования являются дополни-
тельными для оценки тяжести состояния пациента, для
контроля эффективности лечения и прогноза для паци-
ента.
Слайд 27

Пример регистрации кинетики ХЛ (красная линия), накопления продукта реакций ПОЛ (МДА

Пример регистрации кинетики ХЛ (красная линия), накопления продукта реакций ПОЛ (МДА

– фио-летовая линия) и окисления ионов Fe2+ (голубая линия) в суспензии липосом
Слайд 28

Типичная кривая вспышки ХЛ и её параметры Интенсивность ХЛ, отн. ед.

Типичная кривая вспышки ХЛ и её параметры

Интенсивность ХЛ, отн. ед.

Время, мин

Fe2+

t1

t2

Амплитуда
вспышки

максимум

ХЛ (ХЛmax)

α1

α2

+ AO

- AO

Площадь под кривой
(заштрихована) - светосумма, S

tg α1 > tg α2

Время достижения
ХЛmax

Фоновая ХЛ

Общая продолжительность
вспышки ХЛ

Слайд 29

Активированная ХЛ Активированная ХЛ Химические активаторы ХЛ Физические активаторы ХЛ 1.

Активированная ХЛ

Активированная ХЛ

Химические активаторы ХЛ

Физические активаторы ХЛ

1. Химические активаторы ХЛ

(хемилюминогенные
зонды).
Существуют вещества, способные взаимодейство-
вать со СР. В результате образуются соответству-
ющие продукты, находящиеся в электронно-возбуж-
денном состоянии. В итоге, в системе, наряду с
возбужденными продуктами взаимодействия между
СР, появляются ещё и возбуждённые продукты
реакции между СР и химическими активаторами.
Слайд 30

Благодаря этому, увеличивается доля возбужден-ных молекул по отношению к общему числу

Благодаря этому, увеличивается доля возбужден-ных молекул по отношению к общему числу

молекул.
В результате свечение становится более интенсив-
ным.
R* + A ? P*A ? PA + фотон
R*- СР
A - химический активатор
P*A – продукт превращения химического активатора
в возбуждённом состоянием (обеспечивает ХЛ)
PA – продукт в основном (невозбужденном) состо-
янии
Слайд 31

Примеры химических активаторов ХЛ (хемилюми-ногенных зондов): Люминол (3-аминофталевый гидразид) – обеспечи-вает

Примеры химических активаторов ХЛ (хемилюми-ногенных зондов):
Люминол (3-аминофталевый гидразид) – обеспечи-вает интенсивное

свечение в присутствие НО* (сво-бодный радикал гидроксида). Усиливает ХЛ в 70 раз.
Люцигенин (бис(N-метилакридиний) - обеспечивает интенсивное свечение в присутствие *О2- (суперок-сидный анион-радикал кислорода).
Слайд 32

2. Физические активаторы Эти молекулы не вступают в химические реакции со

2. Физические активаторы
Эти молекулы не вступают в химические реакции

со СР.
В основе усиления ими ХЛ лежит физический перенос энергии с молекулы продукта ХЛ-реакции на молекулу активатора:
R ? P* + B ? P + B* (безизлучательный пере-
нос энергии)
B* ? B + фотон (активированная ХЛ)
P* - продукт ХЛ-реакции в возбужденном состоянии
B - физический активатор в основном (невозбуж-
денном) состоянии
B* - физический активатор в возбужденном состо-
янии
Слайд 33

Примеры физических активаторов ХЛ (для реак- ций СРО липидов, т.е. детекция

Примеры физических активаторов ХЛ (для реак-
ций СРО липидов, т.е. детекция

СР липидов – L*, LO* и LOO* ):
Родамин – усиливает ХЛ в 37 раз
Кумарин С-525 - усиливает ХЛ в 1500 раз. При этом на
величину ХЛ не влияет присутствие
АФК.
Слайд 34

Для чего используют измерение активированной ХЛ Обнаружение веществ – катализаторов, разлага-ющих

Для чего используют измерение активированной ХЛ
Обнаружение веществ – катализаторов, разлага-ющих Н2О2

с образованием СР.
Н2О2 – естественный продукт аэробного метабо-
лизма. В норме Н2О2 не накапливается в опасных
концентрациях благодаря работе АО фермента
каталазы.
В условиях окислительного стресса Н2О2 реаги-
рует с ионами металлов с переменной валентно-
стью (прежде всего с ионами Fe2+) или с геминовы-
ми соединениями. В результате образуется *ОН –
радикал – сильнейший окислитель с мощным цито-
токсическим действием.
Слайд 35

1.1. Обнаружение миоглобина в биологических жидкостях. При инфаркте миокарда в моче

1.1. Обнаружение миоглобина в биологических
жидкостях.
При инфаркте миокарда в моче

больного появля-ется миоглобин (выходит из некротизиро-ванных кардиомиоцитов). Миоглобин разрушает Н2О2 и продукты этой реакции взаимодействуют с люми-нолом, обеспечивая интенсивную ХЛ. Интенсивность ХЛ пробы мочи пропорциональна масштабам повреждения миокарда.
Такая лабораторная проба может служить для подтверждения инфаркта, а также критерием как тяжести патологического процесса, так и эффектив-ности терапии.
Слайд 36

1.2. ХЛ раневого экссудата. Реакция воспаления обеспечивает присутствие в экссудате Н2О2,

1.2. ХЛ раневого экссудата.
Реакция воспаления обеспечивает присутствие в
экссудате Н2О2,

гемсодержащих белков и других СР.
Проба экссудата в присутствии люминола даст ин-
тенсивную ХЛ, её величина будет пропорциональна
концентрации СР в экссудате.
В свежей ране, когда активность воспаления мак-
симальна – ХЛ будет наибольшей. По мере заживле-
ния раны (в том числе под действием лечения) интен-
сивность ХЛ в присутствии люминола будет умень-
шаться.
Контроль эффективности лечения раны и оператив-
ная коррекция схемы лечения.
Слайд 37

1.3. ХЛ клеток – фагоцитов. Фагоцитирующие клетки (гранулоциты, моноциты, тканевые макрофаги)

1.3. ХЛ клеток – фагоцитов.
Фагоцитирующие клетки (гранулоциты, моноциты,
тканевые макрофаги) продуцируют

АФК, с помощью которых уничтожаются чужеродные (патогенные) клетки – защитная функция фагоцитов. АФК в при-сутствии люминола (или люцигенина) дают интен-сивную ХЛ. Активированная ХЛ является важным показателем функционального состояния фагоцити-рующих клеток организма.
In vitro cтимуляцию выделения АФК фагоцитирую-
щими клетками можно вызвать добавлением в среду инкубации суспензии бактерий, ЛПС, с помощью электрических импульсов и др. Далее, в присутствии люминола, регистрируют интенсивность ХЛ.
Слайд 38

Люминол-активированная ХЛ фагоцитирующих клеток крови, стимулированных электрическими импульсами (цифры у кривых – сила эл. импульса, вольт)

Люминол-активированная ХЛ фагоцитирующих клеток крови,
стимулированных электрическими импульсами (цифры у

кривых
– сила эл. импульса, вольт)
Слайд 39

Амплитуда люминол-активированной ХЛ лейкоцитов крови больных с различными хроническими патологиями в

Амплитуда люминол-активированной ХЛ лейкоцитов крови больных с различными хроническими патологиями

в стадии обострения. Фагоцитирующую активность клеток стимулиро-вали внесением в среду инкубации частичек латекса.
Вышеуказанные патологические процессы имеют в своем патогенезе – реакцию воспаления (окислительный стресс).