Оптимизация хроматографического процесса

ф а з а

Н е п о д в и ж н а я ф а з а

П о д в и ж н а я ф а з а

Перемещение молекул веществ
между подвижной и неподвижной фазами

Формирование хроматографического пика

вещество 1

вещество 2

и неподвижной фаз в колонке;
t0 – «мертвое» время системы, соответствует времени прохождения по колонке абсолютно не удерживаемого компонента t0 = V0 / s (объемная скорость потока);
t (V) – абсолютное время (объем) удерживания компонента, т.е. от момента ввода пробы до появления центра пика;
t’ (V’) - исправленное время (объем) удерживания компонента,
t’ = t – t0 или (V’ = V – V0)

Хроматографические параметры

t

колонке, температуре, составе элюентов.

Хроматографические параметры

параметры

Разделение вещества

произошедших с веществом при его движении по колонке;

Высота, эквивалентная теоретической тарелке (H) –
физический смысл:

высота слоя сорбента в колонке, на котором происходит единичный акт сорбции-десорбции.

эффективность прямо пропорциональна длине колонки,

Хроматографические параметры

где L - длина колонки.

колонка,
тем уже пик, тем большее число компонентов можно разделить за более короткое время.
Количественно эффективность колонки выражают числом теоретических тарелок N.

ЭФФЕКТИВНОСТЬ

1

1 : Пик симметричен
S > 1 : Наличие хвоста
S < 1 : Наличие «бороды»

в разумно короткое время без потери эффективности (т.е., составить оптимальную хроматографическую систему, используя:
доступные адсорбенты,
набор растворителей,
и эксплуатационные возмож-
ности прибора (температура,
скорость потока).

веществ.

Определение (выделение) крупного класса органических соединений, загрязнителей, пищевых компонентов и т.п.

Определение (выделение) индивидуальных (или небольшой группы) органических соединений, загрязнителей, пищевых компонентов и т.п.

- Экстракция
- Тонкослойная хроматография
- Бумажная хроматография
Колоночная хроматография
низкого давления
- Электрофорез

- Газовая хроматография
Высокоэффективная
жидкостная хроматография

о л я р н о с т ь

л е т у ч е с т ь

ГХ

ВЭЖХ

гидро-
фильные

гидро-
фобные

летучие

нелетучие

водорастворимые
витамины

загрязнителей:

Классы липидов – ТСХ
Органические кислоты (цикл Кребса) – ТСХ, бумажная хроматография
Пигменты растений, животных – ТСХ, ВЭЖХ
Белки, пептиды – электрофорез, ВЭЖХ
Аминокислоты - ВЭЖХ, на ионообменных смолах
Углеводы, мономеры - ВЭЖК, ТСХ
Витамины, кофакторы – ВЭЖХ
Эфирные масла, жирные кислоты, стерины – ГХ
Углеводороды, фенолы, их производные – ГХ, ВЭЖХ
Полимеры, олигомеры – ВЭЖХ, гель-проникающая
Синтетические орг. соединения - ГХ, ВЭЖХ

– дис-изопропилатразин; 2 – метамитрон; 3 – хлордиазон; 4 – дис-этилатразин;5 – кримидин; 6 – карбетамид; 7 – бромацил; 8 – симазин; 9 – цианазин;10 – дис-этилтербутилазин; 11 – карбутилат; 12 – метабензтиазурон; 13 –хлортолурон; 14 - атразин; 15 – монолинурон; 16 – изопротурон; 17 –метазахлор; 18 – метапротрин; 19 – димефурон; 20 – себутилазин; 21 – пропазин; 22 – тетбутилазин; 23 – линурон; 24 – хлорхурон; 25 –прометрин; 26 – хлорпрофарм; 27 – тербутрин; 28 – метолахлор; 29 –пенцицурон; 30 – бифенокс; 31 – пердиметалин.

состава элюента: может включать несколько растворителей с разными пропорциями

Выбор адсорбента (неподвижной фазы) в ВЭЖХ или ГХ
определяется характером разделяемых веществ:
ВЭЖХ: Силикагели, привитые неполярные фазы, ионообменные смолы
ГХ: Кремнийорганические неполярные и малополярные фазы,
органические полярные фазы

Элюирующая сила – способность элюента вытеснять адсобированные анализируемые вещества в поверхности адсорбента

растворителей

Элюотропный ряд - для нормально-фазовой ВЭЖХ

гексан < бензол < хлороформ < ацетон< ацетонитрил < пропанол < метанол

ε воды >1, т.е. растворитель необратимо адсорбируется на поверхности адсорбента

Элюотропный ряд - для обращенно-фазовой ВЭЖХ

вода < метанол < ацетонитрил < этанол < тетрагидрофуран < диоксан

Н20

СН3-0Н

СН3-CH2-0Н

– диполь-дипольные взаимодействия

эфиры

бензол

дихлорметан

формамид

40:30:30

ведущие к изменению взаимодействий адсорбента и аналитов

Градиентный – состав элюентов, т.е..элюирующая сила меняется в ходе анализа по заданной программе, что позволяет подобрать оптимальные условия разделения смесей вещества, ускоряет прохождение анализа.

В – концентрация сильного компонента в подвижной фазе

заданному режиму.

~ Изократический (ВЭЖХ)

Програмирование температуры (ГХ) ~ Градиентный (ВЭЖХ)

абсолютная температура в (°К);
a и b – константы (обычно а > 0).

Понижение температуры замедляет массообмен между сорбентом и элюентом и, следовательно, способствует размыванию пиков.

Повышение температуры может вызывать изменение конформации макромолекул (белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды)

колонки
Влияние этого фактора – константа; минимизуется равномерностью
заполнения колонки и малой вариабельностью размеров частиц.

2. Продольная и поперечная молекулярная диффузия
Чем больше скорость потока, тем меньше размывание по этой причине;

3. Сопротивление массопередаче молекул, перемещающихся из одной фазы в другую.
Чем больше скорость потока, тем больше размывание по этой причине.

где Н – высота, эквивалентная теоретической тарелке, U – линейная скорость потока,
А, В, С - коэффициенты

вклад массопереноса

B/U – вклад диффузии

Н = А + СU + B/U
уравнение Ван-Деемптера

Линейная скорость потока (U)

Uоптим

потока, увеличиваем длину колонки, уменьшаем размер частиц

Меняем тип растворителя, тип или марку неподвижной фазы

пробе

Мера количества вещества в хроматографии: площадь соответствующего ему пика на хроматограмме.

Количественный анализ проводят после идентификации компонента, при которой с достаточной степенью уверенности соотносят пик на хроматограмме с конкретным веществом.

Для отнесения площади пика компонента к его
концентрации в пробе необходимо выполнить калибровку – установление количественной зависимости концентрации от площади пика.

хроматографическом пике

нулевая (базовая) линия

Vr - объем элюента, вытекающий за время удерживания;
h - высота пика в единицах детектирования
w - ширина пика на половине его высоте;
S - площадь хроматограммы, заключенная между пиком и его основанием (нулевой линией).

S = w · h

s

Нулевая (базовая) линия - соответствует нулевой концентрации анализируемых веществ

всех площадей пиков на хроматограмме.

Сi(%) = 100*Si/ ƩS

Метод нормализации пригоден для оценочной характеристики состава разделяемой смеси, либо для биохимических показателей.

30%

20%

50%

Где С – процентное содержание вещества i, Si – площадь пика вещества i

чистом виде - стандарт

Суть метода:
готовят ряд растворов с известными концентрациями стандарта, перекрывающими
ожидаемый диапазон содержания анализируемого компонента в пробе;
растворы последовательно хроматографируют в одинаковых условиях и получают ряд площадей пиков, соответствующих концентрационному ряду калибровочных растворов;
На основании полученных данных строят калибровочный график, по которому определяют концентрацию данного компонента в пробе, находя соответствие площади пика количеству компонента.

Недостатки метода:
необходимость использования стандарта (может быть недоступен в чистом виде, химически лабилен, летуч, токсичен)

S = a·Q + b

виде - стандарт

Суть метода:
в исследуемую пробу вводят известные количества стандарта;
растворы хроматографируют в одинаковых условиях;
на хроматограмме пик определяемого компонента увеличивается пропорционально количеству введенного стандарта;
строят калибровочный график, по которому определяют концентрацию данного компонента в пробе, находя соответствие высоты пика количеству компонента.

Основной недостаток метода:
необходимость использования стандарта (может быть недоступен в чистом виде, химически лабилен,летуч, токсичен)

виде, по
свойствам близкое к определяемому, – внутренний стандарт.

Суть метода:
внутренний стандарт добавляется в анализируемую пробу в известной концентрации;
раствор хроматографируют (необходимо, чтобы при данных условиях разделения внутренний стандарт выходил на хроматограмме в области, свободной от других компонентов пробы);
вычисление концентрации определяемого компонента в пробе проводят по соотношению:

Сi = (Si*Cst)/Sst

При использовании метода внутреннего стандарта линейность детектирования необходимо проверять по отношению ко всем веществам.