ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

сил постоянного электрического поля

Метод был предложен Тизелиусом для разделения заряженных молекул (1925г.).
В 1948 году Тизелиус получил Нобелев-скую премию за разработку методов электрофоретического разделения белков.

обеспечивают молекуле свойства катиона или аниона.

Два важнейших фактора, определяющих эффектив-ность разделения заряженных молекул при электро-форезе:
Отношение эл. заряда молекулы к её массе:
q / m
Молекулы с близкими по величине q, но отличающие-
ся по молекулярной массе.
2. Взаимодействие материала носителя с молекула-
ми разделяемой смеси («эффект молекулярного
сита»).

движущая сила электрического поля, действующая на катионы и анионы - замедляют движение: сила трения и силы электростатического взаимодействия молекулы с материалом носителя.

E x q
V движения =
D x η x F
где: E – напряженность электрического поля
q – заряд молекулы (знак и величина)
D – размер (форма) молекулы (сила трения)
η - вязкость среды
F – силы электростатического взаимодействия
молекулы и материала носителя

- агар
- крахмал
- полиакриламид (ПААГ):
В зависимости от %-концентрации акриламида
(3 – 30%) формируется сеть с заданным разме-
ром ячеек. Это позволяет достигать высокую
эффективность разделения исходной смеси.

100-500 В

Носитель расположен горизонтально

ацетатный буфер
боратный буфер

Буферы обеспечивают:
создают необходимое значение рН, при котором происхо-
дит диссоциация определенных функциональных групп
в разделяемых молекулах (регуляция величины q)
- на поверхности катода и анода происходит электролиз:
на катоде – защелачивание, на аноде – закисление. Это
требует высокой концентрации компонентов буфера:
100 mМ и более. После первого использования буфера,
его порции из катодной и анодной камер уже не смеши-
вают.

чистоты препаратов
- определение молекулярной массы
Препаративный Э/Ф:
уступает по возможностям хромато-
графическим методам

= преры-
вистый, неоднородный.
Формируется гель, в минимальном варианте состоя-
щий из двух слоёв: концентрирующий гель и разде-
ляющий (рабочий) гель (разная %-концентрация
акриламида). В концентрирующий гель (низкая кон-
центрация, крупнопористый) вносят разделяемую
смесь. Это позволяет смеси войти в разделяющий
гель в виде компактной порции, что важно для после-
дующего эффективного разделения компонентов.
Собственно процесс разделения идет в толще раз-
деляющего геля (может состоять из 1 и более слоев
с определенной концентрацией акриламида).

состав включают
буфер для придания электропроводных свойств
будущему гелю.
Растворы смешивают непосредственно перед исполь-
зованием и сразу заливают в соответствующие фор-
мы (пластины или цилиндры), где и происходит поли-
меризация геля.
Каждый слой разделяющего геля формируется после-
довательно. Завершается процесс полимеризацией
концентрирующего геля (процесс идет снизу вверх).
В этом геле заранее, на линии старта, формируют ячей-
ки (углубления), куда будут вносить разделяемую
смесь.

5% ПААГ

Слой
разделяющего
(рабочего)
геля, 7,5% ПААГ

Катодная и анодная
камеры залиты буфером
Трис-глицин, рН 9,5

со всеми остальными носителями. Обусловлена возмо-
жностью варьировать %-концентрацию акриламида и та-
ким образом целенаправленно формировать его разде-
ляющую способность.
Сравнительная простота и быстрота анализа.
Отсутствует электростатическое взаимодействие молекул
с нитями полиакриламида (важно для высокой разделяю-
щей способности геля).
Возможность проведения двумерного электрофоретичес-
кого разделения (двумерный электрофорез).

смеси движется по носителю до тех пор, пока не достигнет зоны, где рН соответ-ствует его изоэлектрической точке (рI), и останавли-вается в этой зоне – происходит фокусирование раз-
личных молекул смеси в разных зонах.
Процедуру проводят в клонках особой конструкции. Их заполняют синтетическими низкомолекулярными носителями (амфолиты) – их индивидуальные pI охватывают весь диапазон значений рН. Это позволяет сформировать градиент рН с любыми заданными крайними значениями.

рI.

Градиент рН возникает при
наложении электрического
поля на амфолиты.

Образец вносится в виде
зоны, либо смешивается по
всей колонке.

Заряженные компоненты об-
разца мигрируют к противо-
положно заряженному элек-
троду. Когда величина рН
оказывается равной рI, дви-
жение компонента смеси
прекращается. В результате
образуются узкие зоны.

один прием смесей белков с очень
близкими физико-химическими свойствами:
Например: изоферментов (различия pI между
разными изоформами могут составлять всего
0,02 ед. рН).

количественного анали-
за смесей различных антигенов.
Формируют пластину из 2% агарового геля. В центре пластины – гнездо для внесения смеси антигенов; вдоль длинного края пластины формируют желобок для внесения антител.
2. В гнездо в центре пластины вносят смесь антигенов и проводят электрофорез. При этом часть антигенов идут к катоду, а часть - к аноду.
Продолжительность около 90 мин.

обнаружить
определенные антигены в изучаемой смеси опре-
деляется составом смеси антител.
Происходит диффузия (16-24 час.) антител в толщу
геля, где они встречают (или не встречают) свои
антигены. Происходит реакция преципитации. Её
результат наблюдают визуально: образуются «дуги»
на месте взаимодействия (встречи) АГ+АТ. Каждый
из антигенов образует «дугу» независимо от других.

Изучаемая смесь АГ

Смесь АТ
известного
состава

«Дуги» -
место образо-
вания иммун-
ных комплек-
сов.

Число образовавшихся дуг = числу антигенов