Молекулярно-биологические методы диагностики

Участок двойной спирали молекулы ДНК.

Схематическое строение ДНК Многоточием обозначены водородные связи

1. Строение моносахаридов:

Строение пуриновых оснований:

Строение пиримидиновых оснований:

Строение нуклеотида:

3. Азотистые основания:

2.

КОМПЛЕМЕНТАРНОСТЬ – последовательность нуклеотидов в одной цепи автоматически определяет строго соответствующую

ТРЕТИЧНАЯ СТРУКТУРА ДНК варианты форм : линейная, кольцевая, 2-х и 1- цепочечная.

ХРОМАТОСОМ: Нуклеосомный кор содержит октамер гистонов (2 х (Н2а+Н2b+H3+H4)). Нуклеосомный кор образуется при

Хроматосомы напоминают нанизанные на нитку бусины. Следующий этап- сворачивание в спираль

Молекулярно-биологические методы диагностики

Гибридизация ДНК
Секвенирование ДНК
Лигазная цепная реакция
Полимеразная цепная реакция

Гибридизация ДНК Метод Эдварда М. Саузерна и Р. Дэйвиса 1975г.

Southern – южный блоттинг

Блоттинг ДНК по Саузерну (1975г)

80оС

Блоттинг ДНК по Саузерну

Использование метода гибридизации

комплексная диагностика инфекционных заболеваний,
наследственные дефекты,
установления экспрессии тех

Секвенирование

Метод расшифровки нуклеотидной последовательности нуклеиновых кислот (Секвенирование ДНК по Сэнгеру)
Метод расшифровки

Лигазная цепная реакция (ЛЦР, LCR - ligase chain reaction)

В основе метода

Использование

Инфекции урогенитального тракта
Chlamydia trachomatis,
Mycobacterium tuberculosis
Различные вирусные инфекции

Kary Mullis 1983г. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

1993г. – Нобелевская премия

Kjell Kleppe в

Полимера́зная цепна́я реа́кция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться

Направления генодиагностики (ПЦР):

Медицинская диагностика (инфекционные заболевания, санитарно-показательные микроорганизмы в пищевых продуктах)
Диагностика

ПЦР: компоненты реакции.

ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.
Два праймера,

ПЦР: компоненты реакции.

Размер праймеров – 18-30 оснований

Открытие термостабильной ДНК-зависимой ДНК-полимеразы (Taq-полимеразы) из термофильных бактерий Thermus aquaticus 1989г.

Представитель домена архей - Pyrococcus furiosus. Анаэроб, обитает в термальных источниках

Представитель домена архей - Pyrococcus woesei (Zillig 1988). Анаэроб, обитает в

Транскрипция ДНК

1-й этап реакции ПЦР (цикл амплификации)

0,5 – 2 мин

0,5 – 2 мин

3'

3'

3'

3'

5'

5'

5'

5'

Размер цепи -3000 пар оснований

1 минута -1000 пар оснований

Геометрическая прогрессия нарастания числа амплификонов

1 – 4
2 – 8
3 – 16
35

Приборы для проведения ПЦР Амплификатор

Настольная центрифуга (скорость 14 500 об/мин)

Термостат - предназначен для термостатирования микропробирок

Настольный ПЦР - бокс

Камера для горизонтального электрофореза S-2N

Флуориметр для детекции результатов ПЦР, позволяющий получить результат, не открывая пробирки,

Фотография геля, содержащего маркерную ДНК (1) и продукты ПЦР-реакции (2,3). Цифрами

Ошибки, встречающиеся при проведении ПЦР-диагностики

Контаминация пробы на стадии отбора материала
Загрязнение

Достоинства ПЦР – анализа:

Высокая скорость
Высокая производительность
Высокая чувствительность и специфичность
Эффективность в отношении

Недостатки ПЦР – анализа:

Узкая направленность (нужно предполагать возбудителя).
Проблема контаминации – строгий

Спасибо за внимание