Содержание
- 2. PCR “polymerase chain reaction” Descrizione della tecnica, metodo, componenti, variabili, strumenti = termociclatori Tecnica: amplificazione esponenziale
- 3. Come si fa la PCR, in cosa consiste amplificazione tramite sintesi de-novo di nuovi filamenti di
- 4. 1 denaturazione del DNA a 94°C 2 appaiamento (“annealing”) dei primers al ssDNA templato, temperatura misurata
- 5. applicazione del sistema naturale la sintesi del DNA è semiconservativa (duplicazione) le DNA polimerasi e anche
- 6. l’invenzione geniale dalla amplificazione lineare a quella esponenziale: la sintesi in vitro di DNA già era
- 7. attenzione al verso dei primers la doppia elica di DNA ha i due filamenti antiparalleli dovuti
- 8. se la reazione in vitro continua 1 doppia elica 2 doppie eliche
- 9. diventa una reazione esponenziale ma come è possibile fare avvenire la reazione senza farla fermare ?
- 10. 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ Denaturazione Extension (Polimerizzazione) Annealing
- 11. Annealing Extension (Polimerizzazione) La crescita e’ esponenziale : teoricamente ad ogni ciclo un raddoppio di DNA,
- 12. vanno determinate per i tempi, temperature e quantita’(conc.) ogni ciclo = 3 passaggi (fasi) I passaggio
- 13. l’enzima sarà una Taq polimerasi (ne esistono diverse ottenute da mutanti che aumentano la specificità, efficienza
- 14. Volume di reazione: da 10 a 50 μl (max 100 μl) per una preparativa. Il DNA
- 15. la PCR si utilizza per amplificare i frammenti random da sequenziare a cui sono stati attaccati
- 16. applicazioni della PCR RT-PCR, nested PCR PCR inversa RACE 3’ e RACE 5’ variazioni sul tema
- 17. Ricerca di un vettore Per inserzione random nel genoma Per inserzione sito specifica nel genoma Cosa
- 18. Cambia la regione limitrofa Gene targeting deve avere regioni limitrofe note a) Random recombination ha regioni
- 19. Altre possibilità di analisi tramite PCR perfezionamenti delle tecniche e degli enzimi - nuove macchine con
- 20. Altre possibili applicazioni della PCR - abbiamo visto RT-PCR tramite reverse transcriptase da mRNA RT-PCR è
- 21. applicazione RT-PCR nuovo esercizio: se devo retrotrascrivere un mRNA per ottenere un un cDNA devo fare
- 22. La reverse trascrittasi RT L’uso della reverse trascrittasi risale a quando furono scoperti i meccanismi molecolari
- 23. RT-PCR: cosa si analizza = analisi della trascrizione di un gene o isolamento di un cDNA
- 24. stratagemmi della RT-PCR Accorgimento: quando si estrae l’RNA si deve evitare il DNA e si puo’
- 25. la retrotrascrizione Per RT si intende reverse transcriptase su templato di RNA Per avere un cDNA
- 26. vantaggi della RT-PCR Analisi della trascrizione tramite PCR Analisi della trascrizione e non determinazione del PM
- 27. come si fa una RT-PCR Si deve ottenere il retrotrascritto cioè il cDNA ( DNA complementare
- 28. RT-PCR dal II filamento in poi Accorgimenti e controlli della RT-PCR Prima di retrotrascrivere il cDNA
- 29. genomic & coding sequence, mRNA, cDNA 5’ 3’ 5’ 3’ PCR su cDNA a due filamenti
- 30. Correzione parametri di una PCR La PCR deve dare dei prodotti che corrispondono agli attesi Quando
- 31. sequenza di un cDNA dalla banca dati per aumentare specificità? facciamo una doppia PCR : la
- 32. la sequenza 5’- 3’ di un cDNA GGATCCCTGT TCCTGATCAC TGATCTCTGG TTCTTTTATT ATGCATATTC 50 ATTTTGAAAT CTGATTCCTT TTCTGAGCAT
- 33. una nested PCR 1 gatcacaggt ctatcaccct attaaccact cacgggagct ctccatgcat ttggtatttt 61 cgtctggggg gtgtgcacgc gatagcattg cgagacgctg gagccggagc
- 34. i controlli essenziali Controlli, negativi, positivi, (i controlli ci fanno capire se l’esperimento è venuto bene)
- 35. procedure la Rev Transcript virale a 37°C, mutanti max 65°C oligo dT, random priming con esanucleotidi,
- 36. precauzioni estrarre RNA eliminando DNA genomico che falsifica il risultato cosa si vuole vedere con RT-PCR:
- 37. può essere quantitativa? la RT-PCR può essere quantitativa l’amplificazione è proporzionale alla quantità di templato l’amplificazione
- 38. perchè quantitativa ? l’amplificazione è proporzionale al templato iniziale, perchè si conserva la proporzionalità anche dopo
- 39. la rivelazione su gel dopo elettroforesi su gel di agarosio si rivela il DNA amplificato come
- 40. controllo di RT-PCR altro controllo negativo : assenza di amplificazione sui campioni di RNA non retrotrascritti
- 41. Controlli della PCR Controlli di estrazione: quali? ripetibilità della amplificazione ripetibilità su campioni indipendenti univocità di
- 42. R.A.C.E. Con la RT-PCR si amplifica solo un frammento del cDNA Se si vuole identificare l’intero
- 43. (Rapid Amplification of cDNA Ends) La RACE è una tecnica per l’amplificazione di sequenze nucleotidiche, usando
- 44. Differenze nella ricerca di 5’ o 3’ ignoti mRNA AAAAA 5’ 3’ poly TTTTT 5’ 3’
- 45. Cerchiamo il 3’ sconosciuto In questo caso si usa un oligo dT per sintetizzare il cDNA
- 46. Dalle banche EST (expressed sequence tags); Da studi di funzione (per esempio EXON e PROMOTER TRAPPING);
- 47. mRNA poly A 5’ noto 3’ ignoto sintesi del I filamento di cDNA con RT con
- 48. Scelta dei primers per la RACE 3’ Il primo primer obbligato è quello per la RT
- 49. RACE 3’ TTT…..TTT 5’ 5’ mRNA poly(A) tail 1 - Annealing tra la coda di polyA
- 50. Nested PCR o PCR interna cDNA 5’ 3’ TTTTT regione nota regione ignota I primer specifico
- 51. un trucco che inganna la polimerasi 3’ 5’ 5’ 3’ primer la polimerase estende da un
- 52. 2 - Degradazione del templato di RNA 3 - Amplificazione per PCR usando un primer specifico
- 53. GSP 2 TTT…..TTT 5’ 3’ AUAP UAP 3’ 5’ La SPECIFICITA’ può essere garantita da un
- 54. PCR nested RACE 3’ Nel caso di una RACE 3’ cambia solo il verso dei primers
- 55. RACE 5’ Cerchiamo il 5’ ignoto Dobbiamo comunque ottenere il cDNA ed utiliziamo gli stessi metodi
- 56. 5’ mRNA poly(A) tail 1 - Annealing tra una regione interna dell’mRNA e un primer gene
- 57. 2 - Retrotrascrizione e tailing all’estremità 3’ del cDNA 5’ AAA….AAA n 5’ 3’ Degradazione mRNA
- 58. Race 5’ fase III I inosina
- 59. mRNA poly A Sintesi del I filamento di cDNA tramite rev.transcript. primer rev. specifico 5’ 3’
- 60. dopo la sintesi del I filam. di cDNA e la terminal transferase, PCR selettiva con II
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