Ретровирусы и ретровирусные векторы МГУ В.С. Прасолов

Июль 27, 2022

Главная
Биология
Ретровирусы и ретровирусные векторы МГУ В.С. Прасолов

Содержание

2. Открытие вирусов 1892 год Д.И.Ивановский – инфекционный фильтрующийся агент, вызывающий табачную мозаику. 1898 год M.Beijerinck -
3. Ретровирусы
4. Классификация ретровирусов
5. morphology of a retrovirus (HIV1, a lentivirus)
6. Схема строения ретровирусного вириона (MuLV)
7. Гены простых и сложных ретровирусов
8. Величина геномов различных ретровирусов
9. Структура геномной РНК простого ретровируса
10. Геномная организация различных ретровирусов
11. Смена рамки считывания, реализуемая при трансляции РНК
12. Образование двух форм ретровирусной РНК
13. Геномная организация РНК трансформирующих вирусов
14. SINGLE-CELL REPRODUCTIVE CYCLE OF MuLV
15. Организация белков оболочки различных ретровирусов
16. RNA-genome of an infectious retrovirus tRNA gag pol env Splicedonor (SD) Splice- acceptor (SA) Ψ R
17. gag pol env R U5 PBS PP U3 R AAAA 3´ The process of reverse transcription
18. gag pol env PP U3 R AAAA 3´ The process of reverse transcription PBS r u5
19. The process of reverse transcription
20. The process of reverse transcription u3 r u5 pbs r u5 PBS u3 pbs pp pp
21. The process of reverse transcription who was copied to where ?
22. Схема обратной транскрипции
23. Genomic organization of murine retroviruses
24. Схема интеграции ДНК провируса в геном клетки хозяина
25. Схема интеграции провируса в геномную ДНК клетки-хозяина
26. Образование молекул РНК простого ретровируса
27. Transcriptional control of MoMLV integrated provirus (Moloney Murine Leukemia Virus, MoMLV)
28. Gene expression of simple retroviruses gag pol env AAAA
29. gag-pol region of simple retroviruses
30. env-region of retroviruses
31. Packaging signal of retroviruses 5´Cap AUG UAG gag pol env +1 AAAA SA
32. Смена рамки считывания, реализуемая при трансляции РНК
33. Геномная организация РНК трансформирующих вирусов
34. Лентивирусы – возбудители медленных инфекций
35. morphology of a retrovirus (HIV1, a lentivirus)
36. Схематическое изображение вирусной частицы HIV-1
37. Этапы развития СПИДа
38. Лентивирусы млекопитающих
39. Структура генома и схема сплайсинга РНК HIV-1
40. Структурные белки HIV-1
41. Неструктурные белки HIV-1
42. Проникновение HIV-1 в клетку
43. Что делает белок Tat
44. Зачем нужен белок Rev
45. Модуляция экспрессии поверхностного антигена CD4
46. Функции вирусных белков 1.Белок Tat увеличивает транскрипцию провирусного генома HIV-1, стимулируя элонгаторную активность РНК-полимеразы II. 2.Белок
47. Вирус Т-клеточного лейкоза 1 типа человека
48. Синтез регуляторных белков HTLV-1 направляется дважды сплайсированными РНК
49. Полиаденилирование и экспорт РНК HTLV-1
50. Белок Tax активирует транскрипцию РНК HTLV-1
51. Клеточные гены, активируемые вирусным белком Tax
60. The concept of Gene Therapy
61. Необходимые свойства эффективной системы переноса и экспрессии гена Высокая эффективность переноса выбранного генетического материала в клетки-мишени(in
62. Выбор метода переноса и экспрессии целевых генов
63. Выбор метода переноса и экспрессии целевых генов (продолжение)
64. retroviral vectors components needed in cis MFG * My Favorite Gene U 5
65. retroviral vectors components needed in trans
66. retroviral replication / packaging of defective particles
67. Coexpression strategies using retroviral vectors
68. Utilized coexpression strategies HoxB4 eGFP SD internal ribosomal entry IRES fusion protein eGFP HoxB4 SD eGFP
69. Calculation of retroviral titers („GFP-Transfer Units“) -> % GFP positive cells x original cell number x
70. Titers of retroviral expression vectors
71. vector production transduction splicing / nuclear export reverse transcription packaging
73. Excision of genes via direct application of Cre-recombinase reporter cell line
76. В процессе работы были получены ретровирусные векторы содержащие в своем составе в качестве маркерного гена ген
77. (А) и трансфицированные (В) клетки 293 при микроскопии в видимом свете. Исходные (Б) и трансфицированные (Г)
78. Кинетика продукции ретровирусного вектора RV-GFP/07-07 упаковывающими клетками HEK293gp. Сбор вируса осуществлялся через 24 часа после трансфекции
79. Кинетика продукции ретровирусного вектора RV-GFP/07-07 упаковывающими клетками HEK293gp. Для переноса использовали 100 мкл культуральной среды трансфицированных
80. Создание клеток продуцентов (перевиваемых фибробластов мыши) секретируемого гормона роста человека с помощью ретровирусного вектора RV-GFP/ 07-07.
81. Продукция гормона роста человека перевиваемыми клетками мыши линии SC1, трансдуцированных ретровирусным вектором R-hGH-IRES-eGFP Электрофоретической разделение в
82. Физическая карта модульного лентивирусного вектора pLPL-mCMV-H4puro Индукция синтеза бета-галактозидазы в перевиваемых клетках рака лёгкого человека H1299,
83. Схема конструкции для экспрессии зеленого флуоресцентного белка с локализацией в эндоплазматическом ретикулуме, на основе нового лентивирусного
84. Испытание лентивирусного вектора pLCMV для стабильной экспрессии зеленого флуоресцентного белка, направляемого в различные структуры клетки
85. Retroviral vectors most commonly used gene transfer system in gene therapy genome integration ensures stable long-term
86. Possible mechanisms of (retroviral) insertional mutagenesis gene X 5‘LTR 3‘LTR 1 2 3 4 5 7
87. ... theoretical risk assessment Starting cell number: 108 Target cell number: 1x109 (1x107 per kg) Transduction
88. Схематическое изображение структурно-функциональных изменений ретровирусного вектора, приводящих к делециям в промоторно-энхансерных областях обоих LTR а) -
89. Env protein Transmembrane Domain TM Surface Protein SU Cell Surface Protein ( Receptor) Binding Trimer-Formation MuLV
90. Neuropathology of DDD mice infected with Mo-AmphoV alone (A–C), or coinfected with Mo-AmphoV and F-MuLV (D–F).
94. M813 expression slightly interferences with ecotropic MuLV infection but not with other MuLVs
95. А) PA 317 cells incubated with M813 for 4h B) Uninfected PA317 Syncytia formation induced by
96. Selection with Geneticin Target Cells TE671 Infection Packaging the Vector into VSV-G Pseudotypes TE671i mCAT1 Establishing
97. Marker-rescue assay (A) Cell with integrated provirus of replication defective virus with marker gene Infection by
98. Marker-rescue assay (B)
99. M813 Does Not Use mCAT1 for Infection SC-1 TE671-neo TE671-mCAT 10A1 Mo-MuLV M813 79% 55% 56%
101. M813 SU Sequences Dictate Receptor Usage MoMuLV MoM813 M813
102. Hamster Cells Murine Cells Irradiation Genome Fragmententation Fusion + Selection 96 Hybrid Clones Per clone: 31%
103. promising candidate gene on Chr. 16: ► Scl5A3 : multiple membrane spanning surface protein encoding SMIT1:
104. Expression of mSMIT1 in Human Cells Imparts Susceptibility to M813 Infection TE671-mSMIT1 52% M1 SC1 M1
105. M813 Induces Syncytia Formation in Cells Expressing Its Receptor Te671 + neo Te671 + mSmit1
106. M813 belongs to a unique receptor interference group M813 is highly fusogenic in vitro and in
107. Acknowledgments Dmitry Ivanov, Pavel Spirin, Tamara Semenova Engelhardt Institute of Molecular Biology Moscow, Russia Sibyll Hein
108. MuLV EXPRESSION IN SC-1 CELLS DETERMINES THE FUSOGENIC PROPERTIES OF SC-1 CELLS
109. М813 INDUCES SYNCYTIA FORMATION MORE EFFECTIVE THAN OTHER MURINE LEUKEMIA RETROVIRUSES
110. Fusion index (FI) = (N - S)/T N – number of nuclei in syncytium S –
111. Gene Therapy trials - overview http://www.wiley.co.uk/wileychi/genmed/clinical/
112. Gene Therapy trials - overview http://www.wiley.co.uk/wileychi/genmed/clinical/
113. Gene Therapy trials - overview http://www.wiley.co.uk/wileychi/genmed/clinical/
114. Инсерционный мутагенез Встраивание провируса может приводить к трансформации клетки
115. Открытие вирусов 1892 год Д.И.Ивановский – инфекционный фильтрующийся агент, вызывающий табачную мозаику. 1898 год M.Beijerinck -
117. Скачать презентацию

Слайд 2

Открытие вирусов
1892 год
Д.И.Ивановский – инфекционный фильтрующийся агент, вызывающий табачную мозаику.
1898

год
M.Beijerinck - “contagium vivum fluidum”.
Loeffler & Frosch – foot-and- mouth disease
1908 год
Ellerman & Bang – ALV
1911 год
P.Rous - RSV

Слайд 3

Ретровирусы

Слайд 4

Классификация ретровирусов

Слайд 5

morphology of a retrovirus (HIV1, a lentivirus)

Слайд 6

Схема строения ретровирусного вириона (MuLV)

Слайд 7

Гены простых и сложных ретровирусов

Слайд 8

Величина геномов различных ретровирусов

Слайд 9

Структура геномной РНК простого ретровируса

Слайд 10

Геномная организация различных ретровирусов

Слайд 11

Смена рамки считывания, реализуемая при трансляции РНК

Слайд 12

Образование двух форм ретровирусной РНК

Слайд 13

Геномная организация РНК трансформирующих вирусов

Слайд 14

SINGLE-CELL REPRODUCTIVE CYCLE OF MuLV

Слайд 15

Организация белков оболочки различных ретровирусов

Слайд 16

RNA-genome of an infectious retrovirus

tRNA
gag pol
env
Splicedonor (SD)
Splice-
acceptor (SA)
Ψ
R

U5 PBS

PP U3 R

AAAA 3´

The process of reverse transcription

Слайд 17

gag pol
env
R U5 PBS
PP U3 R
AAAA 3´
The process

of reverse transcription

Слайд 18

gag pol
env
PP U3 R
AAAA 3´
The process of reverse

transcription

PBS

Слайд 19

The process of reverse transcription

Слайд 20

The process of reverse transcription
u3 r u5 pbs
r
u5
PBS
u3
pbs
pp
pp

Слайд 21

The process of reverse transcription
who was copied to where ?

Слайд 22

Схема обратной транскрипции

Слайд 23

Genomic organization of murine retroviruses

Слайд 24

Схема интеграции ДНК провируса в геном клетки хозяина

Слайд 25

Схема интеграции провируса в геномную ДНК клетки-хозяина

Слайд 26

Образование молекул РНК простого ретровируса

Слайд 27

Transcriptional control of MoMLV
integrated provirus (Moloney Murine Leukemia Virus, MoMLV)

Слайд 28

Gene expression of simple retroviruses
gag pol
env
AAAA

Слайд 29

gag-pol region of simple retroviruses

Слайд 30

env-region of retroviruses

Слайд 31

Packaging signal of retroviruses
5´Cap
AUG
UAG
gag pol
env
+1
AAAA
SA

Слайд 32

Смена рамки считывания, реализуемая при трансляции РНК

Слайд 33

Геномная организация РНК трансформирующих вирусов

Слайд 34

Лентивирусы – возбудители медленных инфекций

Слайд 35

morphology of a retrovirus (HIV1, a lentivirus)

Слайд 36

Схематическое изображение вирусной частицы HIV-1

Слайд 37

Этапы развития СПИДа

Слайд 38

Лентивирусы млекопитающих

Слайд 39

Структура генома и схема сплайсинга РНК HIV-1

Слайд 40

Структурные белки HIV-1

Слайд 41

Неструктурные белки HIV-1

Слайд 42

Проникновение HIV-1 в клетку

Слайд 43

Что делает белок Tat

Слайд 44

Зачем нужен белок Rev

Слайд 45

Модуляция экспрессии поверхностного антигена CD4

Слайд 46

Функции вирусных белков
1.Белок Tat увеличивает транскрипцию провирусного генома HIV-1,
стимулируя элонгаторную активность

РНК-полимеразы II.
2.Белок Rev1 способствует транспорту в цитоплазму вирусных информационных РНК, кодирующих структурные белки HIV-1. Tat и Rev белки в значительной степени стимулируют синтез вирусных белков.
3.Белок Vif увеличивает инфекционность вируса HIV-1, взаимодействуя с клеточной дезоксицитидин дезаминазой. (Vif, присоединяясь к клеточной дезаминазе CEM15 индуцируя убиквитинизацию и последующую деградацию этого фермента протеосомами).
4. Белок Vpr важен для переноса преинтеграционного комплекса HIV-1 из цитоплазмы в ядро.
5. Белок Vpu усиливает выход вирусного потомства из заражённой клетки.
6. Белок Nef – важный медиатор патогенеза (Nef снижает уровень экспрессии белков CD4 и MHC на поверхности клетки. Влияет на инфекционность вируса и изменяет сигнальные пути: взаимодействие Nef c src-родственными киназами lyn и hck, приводит к их активации. А взаимодействие Nef с lyc и fyn приводит к их подавлению. Активация hck приводит к увеличению экспрессии в T клетках ряда цитокинов и хемокинов, что в свою очередь увеличивает репликацию HIV-1 и привлекает больше T-клеток к очагу заражения)

Слайд 47

Вирус Т-клеточного лейкоза 1 типа человека

Слайд 48

Синтез регуляторных белков HTLV-1 направляется дважды сплайсированными РНК

Слайд 49

Полиаденилирование и экспорт РНК HTLV-1

Слайд 50

Белок Tax активирует транскрипцию РНК HTLV-1

Слайд 51

Клеточные гены, активируемые вирусным белком Tax

Слайд 52

Слайд 53

Слайд 54

Слайд 55

Слайд 56

Слайд 57

Слайд 58

Слайд 59

Слайд 60

The concept of Gene Therapy

Слайд 61

Необходимые свойства эффективной системы переноса и экспрессии гена
Высокая эффективность переноса выбранного

генетического материала в клетки-мишени(in vivo и in vitro)
Простота и высокая воспроизводимость метода трансдукции
Стабильная экспрессия внесённого гена
Возможность направленной регуляции экспрессии
Регулируемый тропизм (способность избирательно вносить экспрессируемые гены в клетки определённых типов)

Слайд 62

Выбор метода переноса и экспрессии целевых генов

Слайд 63

Выбор метода переноса и экспрессии целевых генов (продолжение)

Слайд 64

retroviral vectors
components needed in cis
MFG
* My Favorite Gene
U 5

Слайд 65

retroviral vectors
components needed in trans

Слайд 66

retroviral replication / packaging of defective particles

Слайд 67

Coexpression strategies using retroviral vectors

Слайд 68

Utilized coexpression strategies
HoxB4
eGFP
SD
internal ribosomal entry
IRES
fusion protein
eGFP HoxB4
SD
eGFP
SD
HoxB4
2A
cotranslational separation

Слайд 69

Calculation of retroviral titers („GFP-Transfer Units“)
-> % GFP positive cells x

original cell number x 2 (x dilution)

Слайд 70

Titers of retroviral expression vectors

Слайд 71

vector production
transduction
splicing / nuclear export
reverse transcription
packaging

Слайд 72

Слайд 73

Excision of genes via direct application of Cre-recombinase
reporter
cell line

Слайд 74

Слайд 75

Слайд 76

В процессе работы были получены ретровирусные векторы содержащие в своем составе

в качестве маркерного гена ген зеленого флуоресцирующего белка или ген желтого флуоресцирующего белка, RV-eGFP/07-07 и Rv-tYFP/07-07, соответственно, и лентивирусные векторы, несущие в своем составе маркерный ген зеленого флуоресцирующего белка, по своим свойствам не уступающие лучшим зарубежным образцам, а по некоторым параметрам и превосходящие их.
Была разработана методика получения рекомбинантных ретровирусных частиц, обеспечивающая получение стоковых растворов с высоким титром (до 106 ИВЧ/мл).

Слайд 77

(А) и трансфицированные (В) клетки 293 при микроскопии в видимом свете.

Исходные (Б) и трансфицированные (Г) клетки 293 при микроскопии в ультрофиолетовом свете (λмакс= 488 нм).

Экспрессия гена GFP (зелёного флуоресцирующего белка,
внесённого в клетки) почки эмбриона человека линии 293, внесённого в составе ретровирусного вектора RV-GFP/07-07

Слайд 78

Кинетика продукции ретровирусного вектора RV-GFP/07-07 упаковывающими клетками HEK293gp.
Сбор вируса осуществлялся

через 24 часа после трансфекции клеток HEK293gp с интервалом 10-12 часов. Титрование осуществляли на клетках мишенях SC-1. Для переноса в клетки SC-1 использовали 20 мкл культуральной среды трансфицированных упаковывающих клеток.

Слайд 79

Кинетика продукции ретровирусного вектора RV-GFP/07-07 упаковывающими клетками HEK293gp.
Для переноса использовали

100 мкл культуральной среды трансфицированных упаковывающих клеток.

Слайд 80

Создание клеток продуцентов (перевиваемых фибробластов мыши) секретируемого гормона роста человека с

помощью ретровирусного вектора RV-GFP/ 07-07.

Карта ретровирусного вектора R-hGH-IRES-eGFP

Слайд 81

Продукция гормона роста человека перевиваемыми клетками мыши линии SC1, трансдуцированных ретровирусным

вектором R-hGH-IRES-eGFP

Электрофоретической разделение в полиакриламидном геле в динатурирующих условиях зрелого гормона роста человека, полученного из культуральной среды трансгенных клеток, геном которых содержит интегрированный рекомбинантный вектор R-hGH-IRES-eGFP при помощи иммуносорбентной колонки (1) и зрелого гормона роста человека, полученного из клеток E.coli (3), (2)-маркёрные белки. Концентрация зрелого гормона роста человека, в кондиционированной среде трансгенных клеток SC1 составляла 5-8 мкг/мл.

Слайд 82

Физическая карта модульного лентивирусного вектора pLPL-mCMV-H4puro
Индукция синтеза бета-галактозидазы в перевиваемых клетках

рака лёгкого человека H1299, имеющих делецию гена p53 с помощью лентивирусного вектора pLPL-mCMV-H4puro, несущего ген p53 дикого типа.

Перенос целевых генов в клетки человека с помощью лентивирусного вектора pLPL-mCMV-H4puro

Слайд 83

Схема конструкции для экспрессии зеленого флуоресцентного белка с локализацией в эндоплазматическом

ретикулуме, на основе нового лентивирусного вектора pLCMV-NP-neo

Дополнительно, для направления продуктов в определенные структуры клетки в область, примыкающую к промотору CMV и участку клонирования введены последовательности, кодирующие N-концевые пептиды – сигналы внутриклеточной локализации. Эти сигналы включают: пептид кальретикулина, отвечающий за локализацию в эндоплазматическом ретикулуме, пептид нейромодулина, направляющий белки в плазматическую мембрану, и пептид цитохром С оксидазы, направляющий белок в митохондрии.

Компартмент адрессованная экспрессия генов целевых белков, направляемая лентивирусным вектором.

Слайд 84

Испытание лентивирусного вектора pLCMV для стабильной экспрессии зеленого флуоресцентного белка, направляемого

в различные структуры клетки

Слайд 85

Retroviral vectors
most commonly used gene transfer system in gene therapy
genome integration

ensures stable long-term expression
BUT
any genome integration may be associated with insertional mutagenesis
(... which may in the worst case lead to malignant transformation)

Слайд 86

Possible mechanisms of (retroviral) insertional mutagenesis
gene X
5‘LTR
3‘LTR
1
2
3
4
5
7
LCR
Enhancer
Promotor
Terminator
Exons
Intron
Exons
MAR
Integration
6
4 & 5: Change of

protein coding region (e.g. gene truncation), enhancer or silencer activity, termination of transcription

1 & 7: Alteration
of gene control regions

2 & 3: Direct promotor, enhancer
or silencer activity

6: Influence
on RNA stability

... at least some of these mechanisms do occur !!!

Слайд 87

... theoretical risk assessment
Starting cell number: 108
Target cell number: 1x109

(1x107 per kg)

Transduction efficiency: 25-30% ? 3 x 107 insertions

Genome size: 3 x 109 bp

Random integration would statistically result
in one insertion every 100 bp!!!

Слайд 88

Схематическое изображение структурно-функциональных изменений ретровирусного вектора, приводящих к делециям в промоторно-энхансерных

областях обоих LTR

а) - ретровирусный вектор (оба LTR содержат энхансерно-промоторную область)
б) - самоинактивирующийся вектор в виде провируса в геноме упаковывающей клетки
в) - самоинактивирующийся вектор в виде провируса, интегрированного в геном клетки-мишени

Слайд 89