Масс-спектрометрия в протеомных исследованиях. Часть 2: Приложения

идентификация белка;
3) уточнение первичной структуры;
4) определение пост-трансляционных модификаций.

2D-электрофорез
Специфический гидролиз
MALDI-MS

Специфический гидролиз
Хроматография
ESI-MS-MS, микросеквенирование

ПРОТЕОМИКА – набор высокотехнологичных методов установления состава сложных смесей белков

Белковые чипы

как правило отличен от имеющегося в базе данных

Для идентификации белка по его молекулярной массе
необходима точность ее измерения < 2ppm

Такая точность доступна при использовании масс-спектрометрии ИЦР

В базе данных NCBI nr более 2 500 000 записей

Пример: при анализе всех цитозольных белков бактерии Rhodobacter
с использованием масс-спектрометрии ИЦР идентифицировано около 10% белков, пики которых наблюдались в спектре. Массы остальных белков были отличны от рассчитанных по гену из-за наличия пост-трансляционных модификаций.

анионообменная, катионообменная.

Биомаркер рака яичников

Для идентификации белков отличий
необходимо их выделение.

Детектируются, как правило, хорошо
представленные белки.
В данном случае –
сывороточный амилоид А1

фрагментах геля

Экстракция пептидов и получение
MALDI масс-спектра суммарного гидролизата

Поиск в базе данных измеренных масс пептидов
(пептидный фингерпринт)

Post Source Decay-MS, TOF-TOF
фрагментация отдельных пептидов

Поиск в базе данных измеренных масс фрагментов

Стратегия анализа: 2DE + MALDI-MS

разделение
по массам белков 10-200 кДа

Первое направление – изоэлектрическая фокусировка
Второе направление – разделение по массам в полиакриламидном геле

Белки, растворенные в неионном детергенте,
вносятся в гель с фиксированным градиентом рН

щелочными
и гидрофобными белками
Невысокая воспроизводимость

Окраска: Чувствительность:
Кумасси голубым 50 нг/пятно
Серебром, совместимая с MS анализом 1 нг/пятно
Серебром, классическая 0.1 нг/пятно

одном геле.
Зеленым (Cy3) – белки из контрольных клеток,
Красным (Cy5) – белки из обработанных клеток.
Достоинства: Очень чувствителен, прекрасное сопоставление пятен, очень точен и удобен для оценки экспрессии белка
Недостатки: Недолговечность флуоресценции (сутки), требует дорогих сканеров, непригоден для вырезания пятен без дополнительной окраски серебром

масс

список масс пептидных фрагментов

Вырезание отдельных белковых пятен (>20 нг/мм2)
Трипсинолиз белков в фрагментах геля
Получение масс-спектра

www.matrixscience.com

Схема проведения идентификации белка по его пептидному фингерпринту

количество кандидатов

масс пептидов

«уникальные»

В базе данных NCBI nr более 2 500 000 записей

предположении одного белка
количество «совпавших» пептидов, в предположении нескольких белков
распределение «совпавших» пептидов по точности
«уникальность» пептидов
перекрывание «совпавшими» пептидами последовательности белка
паттерны протеолиза
oтклонение массы белка от предполагаемой и т. д.

измеренные m/z

база данных

Приоритет критериев
2, 4, 7
программа Profound

Приоритет критериев
1, 5, 6
программа Mascot

Score

A virus]
gi|4996872 26451 74 M1 [influenza A virus (A/Taiwan/96/1769)]
gi|324260 27872 73 M1 subunit [Influenza A virus]
gi|75116 27866 73 M1 - influenza A virus (strain A/WSN/33)
-------------
20. gi|6048806 27218 58 M1 [Influenza A virus (A/Duck/Hong Kong/698/79 (H5N3))]

Sequence Coverage: 35%
IVPSGPLKAE IAQRLEDVFA GKNTDLEVLM EWLKTRPILS PLTKGILGFV FTLTVPSERG LQRRRFVQNA LNGNGDPNNM DKAVKLYRKL KREITFHGAK EIALSYSAGA LASCMGLIYN RMGTVTTEVA FGLVCATCEQ IADSQHRSHR QMVTTTNPLI RHENRMVLAS TTAKAMEQMA GSSEQAAEAM DIASQARQMV QAMRTIGTHH SSSAGLKDDL LENLQAYQKR MGVQMQRFK

20 кандидатов в порядке убывания достоверности поиска

массы 20 кандидатов

вероятность

случайное
совпадение

достоверный
поиск

Идентификация белка заменяется нахождением его ближайшего гомолога

Изучаемый белок обычно отличен от имеющегося в базе данных

2E1
2. gi|10834998 57381 149 ----//----
3. gi|6470141 57353 138 ----//----
4. gi|6166183 60776 134 DIMETHYLANILINE MONOOXYGENASE
5. gi|6325467 60794 123 ----//----
6. gi|13643376 60921 113 ----//----
7. gi|284102 60462 111 ----//----
8. gi|5705937 55015 73 CYTOCHROME P-450 IIC
9. gi|226295 55481 73 ----//----
10. gi|219571 56182 72 ----//----
11. gi|13699818 56515 72 ----//----
……………………
18. gi|4758794 776492 64 NEBULIN

Cпектр гидролизата смеси белков (1DE)

gallisepticum 105

MW
200
150
100
70
50
30
20
10

pI 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8

Mycoplasma gallisepticum strain R

Protein coding genes - 726

контрольной (А) и устойчивой к Hoechst33342 (Б)

2DE карты белков штамма клеток E.coli (А) и штамма-продуцента треонина (Б)

2DE карты клеточных белков двух штаммов Helicobacter pylori

Всего видно на геле ~1200 белковых пятен
Видимых различий ~ 50
Идентифицировано ~ 30 белков отличия

Всего видно на геле ~ 500 белковых пятен
Видимых различий ~ 200
Идентифицировано ~ 150 разных белков
Из них белки отличия ~ 100

Всего видно на геле ~ 2500 белковых пятен
Видимых различий ~ 30
Идентифицировано ~ 10 белков отличия

Примеры анализа 2DE карт

данных
и анализ

1D электрофорез белков

Вырезание и трипсинолиз белков в полосах геля

Экстракция и хроматографическое
разделение пептидов

– фрагментация, индуцированная захватом медленных электронов

Пептид поглощает энергию лазера, захваченная энергия перераспределяется по молекуле, разрушается ближайшая слабая связь.
Основной тип образовавшихся пептидных фрагментов - b-ионы и y-ионы.
Может происходить отщепление модификаций.

Пептид приобретает энергию от столкновений, захваченная энергия перераспределяется по молекуле, разрушается ближайшая слабая связь.
Основной тип образовавшихся пептидных фрагментов - b-ионы и y-ионы.
Дополнительно образуются a-ионы и x-ионы.
Часто происходит отщепление модификаций.

Точный механизм неизвестен. Пептид захватывает медленные электроны на азот пептидной связи, происходит мгновенный разрыв пептидной цепи с образованием
z- ионов.
Не происходит отщепления модификаций.

m/z
2. «Примерка» спектров фрагментации (MS/MS) :
количество «совпавших» фрагментов пептидов
«уникальность» спектров фрагментации пептидов
3. Score белка = Σ Score пептидов

измеренные m/z

база данных

Score

Критерии достоверности поиска белков в базах данных: peptide fingerprint + MS/MS

Score пептидов

белков
Mycoplasma gallisepticum - 427

Эксп.1

Эксп.2

Эксп.3

Белки, которые обнаружены
хотя бы в 1 эксперименте - 427
Белки, которые обнаружены
хотя бы в 2 экспериментах - 285
Белки, которые обнаружены
во всех 3 экспериментах - 155

155 ?

MW
200
150
110
70
50
30
20
10

Белки, которые обнаружены при проведении 2DE+MALDI-MS - 90

Mycoplasma gallisepticum strain R

mW score
conserved hypothetical lipoprotein gi|31541381 85818 119
conserved hypothetical lipoprotein gi|31541566 100472 130 conserved hypothetical lipoprotein gi|31541571 120325 273
conserved hypothetical lipoprotein gi|31541607  130197 205 conserved hypothetical lipoprotein gi|31541608 133826 168

Protein № NCBI mW score
conserved hypothetical lipoprotein gi|31541381 85818 127
conserved hypothetical lipoprotein gi|31541566 100472 817
HepA/SNF gi|31541753 132618 341
conserved hypothetical lipoprotein gi|31541571 120325 2152
conserved hypothetical lipoprotein gi|31541607  130197 1781
lipoprotein gi|45453612 18284 313
lipoprotein gi|45453638 18339 362
lipoprotein gi|33327196 25889 436
conserved hypothetical lipoprotein gi|31541608 133826 1008

разделение пептидов + MS/MS

Достоинства:
Анализируются все меченные белки
Анализ содержания одного белка в
контроле и опыте

Ограничения:
Не видно взаимных количеств
разных белков в образце
Артефакты в интерпретации MS/MS

Выделение цистеинсодержащих пептидов
(афинное связывание с авидином)

сумме дающих массу родительского иона
по наличию соседних пиков +/-28, +/-15 определение типа ионов
по разнице масс соседних однотипных ионов построение
возможных последовательностей

l/ L/ T/ S/ A/ V/…

Степень фрагментации зависит
от многих параметров и плохо предсказуема.

Ограничения cиквенирования de-novo
при использовании MALDI-TOF-MS :
* не бывает равномерного разбиения
по всем пептидным связям
* не хватает точности измерения
для однозначной интерпретации

MALDI фрагментация пептидов (LID +CID)

разделения в ПААГ

цистеины алкилированы йодоацетамидом (в геле)

Лизоцим

Т11

Т9

Т6

Т13

Т13-14

Cys + I ацетамид
Cys + акриламид
Met окислен

Модификации in vivo:

Изучение S-S мостов

на N-концевом серине ?

Стабильность различных модификаций белков в условиях получения масс-спектров (LID + CID)

Pi

N-ac

Фрагмент спектра трипсинолиза природного (верх)
и генно-инженерного (низ) белка

Такова степень фосфорилирования ?

Связи менее устойчивые,
чем пептидная:
фосфоэфирная
гликозидная
дисульфидная (иногда)

сопоставимые по
устойчивости с пептидной:
тиоэфирная
любая амидная -
N-ацетилирование
дисульфидная (иногда)

Пептид, модифицированный тремя пальмитатами
(тиоэфирная связь)

Пептид N- ацетилирован, а цистеин модифицирован
янтарным ангидридом (тиоэфирная связь)

-
соотнесение значений масс пиков в спектре с первичной структурой.
Определение пептидов отличных по массе от рассчитанной –
гипотезы о природе модификации
Индивидуальный подход к получению структурной информации из спектров фрагментации –
выбор типа фрагментации, использование ферментов для дальнейшего расщепления
пептида, удаления модификации, химические подходы...

Стратегия определения модификаций: