Реакции иммунного лизиса. Реакция связывания комплемента (РСК)

Пути активации системы комплемента

Принцип реакций иммунного лизиса.

=

+

Клетка-мишень, сенсибилизированная антителами-лизинами

Комплемент

Лизис
клетки-мишени

Реакция агглютинации и лизиса
лептоспир

Реакция гемолиза

Реакция связывания комплемента (РСК)

1 фаза – диагностическая
АТ + АГ
(сыворотка больного) (диагностикум гонококковый)
К
______________________________________________________
2 фаза

1 фаза – диагностическая
АТ АГ
(сыворотка больного) (диагностикум гонококковый)
К
______________________________________________________
2 фаза –

Протокол. Реакция связывания комплемента

Схема постановки основного опыта РСК

37˚ С - 1 час

Конкурентный радиоиммунный анализ

Высокий титр антител - низкая радиоактивность

Низкий титр антител -

ИФА

Иммуноферментный анализ
- выявление антигенов или антител с помощью

ф

ф

ф

Иммуноферментный анализ
выявление антигенов

ЛУНКА
С

ф

ф

ф

Иммуноферментный анализ
выявление антител

АНТИГЛОБУЛИНОВАЯ
СЫВОРОТКА
С

ф
gC-1
gB-1
gD-1
gG-2

ф

ф

ф

ф

ф

ф

ф

ф

ф

ф

ф

ф

ф

ф

ф

ф
gC-1
gB-1
gD-1
gG-2

ИММУНОБЛОТИНГ (Herpes Simplex Virus Ig)

БЛОТ
С НАНЕСЕННЫМИ

Определение Ig G

Протокол. Иммуноферментный анализ

Лунка с HBcAg Антитела больного

Субстрат

1 2 3 4

Получены показатели ОП исследуемых сывороток.

1 2 3 4

ПОЛИМЕРАЗНАЯ
ЦЕПНАЯ
РЕАКЦИЯ

Полимера́зная цепна́я реа́кция (ПЦР) — метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций

1953 открытие двойной спирали ДНК (Уотсон и Крик)
изобретение ПЦР (Кэри Маллис)
1993 за

1. Пробоподготовка

2. Амплификация

Этапы классического ПЦР-анализа

3. Детекция результатов

Пробоподготовка – выделение нуклеиновых кислот

ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ:
лизис
изоляция НК
освобождение от ингибиторов
элюция

Минимальный состав смеси для ПЦР
ДНК-матрица
олигонуклеотидные праймеры
cмесь dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP)
полимераза
буферный

Этапы ПЦР
Денатурация ДНК (~ 950 C)
Отжиг (гибридизация) праймеров на ДНК

ДНК

праймер или зонд (синтетический фрагмент ДНК)

соответствующий участок матрицы (мишени)

праймеры – короткие

праймер

соответствующий участок матрицы (мишени)

Фермент ПЦР –Taq полимераза (выделена из бактерии Thermus

Удлинение цепей ДНК-полимеразой

Продукт ПЦР – двуцепочечный специфический фрагмент ДНК (ампликон)

94-96° С

50-65 ° С

72 ° С

денатурация (плавление двуцепочечной ДНК-матрицы)
10 сек –

Дополнительная стадия для РНК-содержащих возбудителей
РНК не может быть матрицей для ПЦР!

кДНК

РНК

праймер

далее

По конечной точке
(после окончания реакции)

В реальном времени
(после каждого цикла)

FLASH

ГИФА

Электрофорез

Реал-тайм

Детекция электрофорезом

Разделение фрагментов ДНК (ампликонов) в геле в соответствии с их

ГИФА – гибридизационный иммуноферментный анализ

амплификация

перенос реакционной смеси в лунки иммунологического планшета

отмывки

реакция

Детекция в формате FLASH

Вариант детекции «по конечной точке»
Аналитический сигнал – прирост

Детекция продуктов ПЦР в режиме реального времени

λ

Технология TaqMan

×2

×4

×8

×16

Цикл 1

Накопление продукта амплификации

Цикл 2

Цикл 3

Цикл 4

«Пороговый цикл» Ct

«Фон»

«Порог»

«Пороговый цикл»

Пороговый цикл Сt – значение цикла

Наименьшее количество

Наибольшее количество

Чем больше значение Ct, тем меньше концентрация исходной НК

Мультиплексирование: возможность исследовать несколько маркеров
одновременно

Две (или более) разные мишени в

АМПЛИФИКАТОРЫ

Stratagene Mx3005P

One Step Plus

CFX 96

iQ 5

АНК-32

SmartCycler II

Cobas TaqMan

ДТ-96

Rotorgene 6000