Микробиологическая характеристика возбудителя сибирской язвы

Давен

Bacillus anthracis (окраска по Граму)

После фиксации бациллы на клетках макроорганизма, клетка быстро гибнет.

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА BACILLUS ANTHRACIS (капсула)

Споры (эндоспоры) - особый тип клеток, характеризующихся резко сниженным уровнем метаболизма и высокой резистентностью к воздействию различных факторов.
У бацилл споры являются защитной формой существования. Споры образуются под влиянием неблагоприятной температуры, недостатка влаги или питательных веществ в окружающей среде, необходимых для вегетации.

Bacillus anthracis (окраска спор по Граму - слева), по Михину - справа)

Резервуаром возбудителя сибирской язвы в природе служит почва, в которой споры сохраняются длительное время.
В зависимости от типов почв до 100 лет, срок не определен

- образование оболочек: вначале между мембранами проспоры образуется зачаточный пептидогликановый слой кортекса и вокруг его наружной мембраны формируется споровая оболочка;
- созревание споры: заканчивается образование всех структур споры, она становится термоустойчивой, приобретает характерную форму и занимает определенное положение в клетке.

Спора разрывается, на месте разрыва оболочки споры возникает ростовая трубка и формируется вегетативная клетка. Оптимальными температурными условиями являются 37OС, аэрация и наличие необходимых питательных веществ.

В опытах на морских свинках показано, что при вдыхании спор 100% животных погибает, проросших спор – 31%, при вдыхании вегетативных клеток заболевание животных не наблюдалось.

Культуральные свойства Bacillus anthracis

Синтезирует лецитиназу.
Очень медленно разжижает желатину (рост в виде перевернутой елочки).
Микроб не обладает гемолитической активностью (не образует зону гемолиза вокруг колонии).
Не обладает фосфатазной активностью (колонии не меняют цвет).

Возбудитель сибирской язвы продуцирует сильный экзотоксин, обусловливающий тяжесть течения болезни. Токсин контролируется плазмидой pX01.
Сибиреязвенный экзотоксин представляет собой белковую молекулу, состоящую из трех субъединиц (факторов):
отечный;
протективный;
летальный .
Отечный фактор (фактор I) вызывает местную воспалительную реакцию - отек и разрушение тканей.
Протективный фактор (фактор II) - носитель защитных свойств, обладает выраженным иммуногенным действием, так как в ответ на его введение образуются антитела;
Летальный (фактор III) вызывает гибель животных.

Там эти токсины и осуществляют свое цитотоксическое действие: вместе с экзопротеазами вызывают резкие нарушения клеточного обмена, приводя к деградации и гибели клетки. Токсин вызывает повреждение сосудов с отеком, гемморагиями и тромбозом в результате повышения под действием токсина проницаемости эндотелиальных клеток.

Плазмида рХО2 содержит наиболее значимые гены, определяющие синтез капсулы:
Cap A
Cap B
Cap С

Определено, что различие между штаммами B. anthracis обусловлено существованием в геноме бактерий вариабельного числа тандемных повторов (Variable Number Tandemly Repeats, VNTR).

Штаммы были типичными по основным биологическим свойствам – образовывали капсулу, споры и были высоковирулентны для лабораторных животных.

- Эти и другие факты, свидетельствуют о неопределенно долгом сохранении возбудителя сибирской язвы в почве, без снижения их вирулентных свойств.

Чувствительность к действию специфического сибиреязвенного бактериофага является одним из основных критериев, по которым идентифицируют сибиреязвенные культуры.

Высокую диагностическую ценность имеет чувствительный и специфичный тест «жемчужного ожерелья». В доступной литературе нет сообщений об отрицательных результатах теста при исследовании сибиреязвенных бацилл.
У близкородственных микроорганизмов отрицательный тест «жемчужного ожерелья».

Сибиреязвенный микроб неподвижный, в отличии от близкородственных.

высоко вирулентные штаммы вызывают гибель кроликов при введении 10 тысяч спор;
умеренно вирулентные – при введении 100 тысяч спор и 1 млн;
слабовирулентные и авирулентные штаммы не вызывают гибели кроликов в указанных дозах. Летальную дозу определяют на белых мышах.

Для заражения человека требуется доза в 10000 м.к.

Аэрозоль образуется при любой деятельности, передающей энергию жидкости или материалу

Источник: Bacillus anthracis
(любой инфекционный материал)
Лабораторные процедуры:
1) посевы на среды;
2) пипетирование;
3)заражение животных;
4) заражение членистоногих;
4) центрифугирование
Пути передачи:
1)контактный;
2) воздушно-капельный;
3)алиментарный;
4)трансмиссивный.
Факторы передачи:
1)объекты с посевами B.anthracis;
2) бактериальная аэрозоль;
3)зараженные лабораторные
животные;
4)зараженные членистоногие

1) при заражении лабораторных животных, уходе за ними (аэрозоль, укусы, нанесение царапин);
2) при вскрытие лабораторных животных, взятие крови (прямое воздействие возбудителя на кожу, слизистые оболочки);
3) при пипетировании (проливании и разбрызгивании заразного материала);
при центрифугировании;
вскрытии ампул;
6) при попадании в рот;
7) при вдыхании бактериального аэрозоля (при аварии);
8) при укусе насекомыми

Если подозрение на сибирскую язву возникло при вскрытии трупа животного или в ходе вынужденного убоя, все манипуляции по вскрытию прекращают и на исследование направляют кровь, кусочки органов (селезенка, печень, лимфатические узлы, в которых имеются характерные патологоанатомические изменения), костный мозг (из грудины или канала бедренной кости).

Исследованию подлежит мясо, мясные продукты, кожа, шерсть и др.;
Мясо и мясные продукты. Из материала, доставленного на исследование, отбирают образцы весом 10 – 30 г, из мяса - участки с лимфоидной тканью или кровоизлияниями.
Шерсть. Шерсть для исследования отбирают из разных мест, не менее 5 образцов массой около 2 г каждый (брать пучки загрязненной шерсти). Если шерсть упакована в кипы, берут не менее 10 образцов из разных мест каждой кипы, а также скопившуюся внутри обшивки пыль. Образцы от одной кипы объединяют и упаковывают вместе.

Кожа и кожсырье. Берут кусочки кожи размером 3х3 см с периферических не загнивших и не заплесневевших участков шкурок. При наличии на внутренней стороне шкурки кровоподтеков или инфильтратов пробы берут и в этих местах.

Почва. Пробы почвы с мест вероятного обсеменения спорами возбудителя (мест вынужденного убоя скота, стоянок и водопоя животных) берут на глубине до 15 см, на территории почвенных очагов сибирской язвы - на глубине до 2 м с помощью почвенных буров.

При этом при заборе проб с большой территории обследуемую площадь разбивают на квадратные участки со стороной не более 4 м. В каждом квадрате намечают 4 точки по краям и одну посередине, откуда производят отбор проб почвенным буром.

Нельзя помещать пробы почвы в полиэтиленовые мешки или в плотно закрытую посуду, так как в этих условиях происходит бурное развитие актиномицетов, губительно действующих на возбудителя сибирской язвы.

Транспортирование и хранение биологического материала для исследования должны осуществляться с соблюдением "холодовой цепи":
Допускается только однократное замораживание - оттаивание материала.

Пробы воды наливают в стерильные одноразовые (многоразовые) флаконы, нумеруют, упаковывают во влагонепроницаемую тару, которую обвязывают, пломбируют.
Пробы материала и сопроводительные документы доставляются нарочным на спецтранспорте.

Сроки исследования:
∙ Микроскопический - в день поступления
∙ Бактериологический - до трех суток
∙ Биологический - до 10 суток

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА

Осадок с каждого фильтра соскабливают скальпелем (или фильтры измельчают стерильными ножницами), затем заливают 1 – 2 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида. Осадок после центрифугирования также суспендируют в 15 – 20 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида.

Различные порошкообразные вещества, в том числе пищевые продукты и корма, обрабатывают аналогично почве, используя в дальнейшем для исследования надосадочную жидкость или раствор в случае растворения вещества, объем пробы доводят до 15-20 мл раствором хлорида натрия.

От каждой пробы шерсти отбирают наиболее загрязненные части, измельчают ножницами, вместе с пылью помещают в колбу и заливают стерильным 0,9%-м раствором натрия хлорида (15 – 20 мл). Колбу закрывают, тщательно встряхивают в течение 5 – 10 мин. Для освобождения от грубых частиц взвесь можно профильтровать через 2 – 3 слоя марли.

Бактериологическое исследование

Исследование доставленного материала начинают сразу (без предварительной подготовки) с бактериоскопии. Готовят несколько мазков. Окраску проводят по Граму, люминесцирующей сывороткой, Михину, Гинс-Бури или другим методом для обнаружения капсулы.

Незагрязненный материал (кровь, экссудат).
Пробы от больных животных, из патологического материала,
мяса животных, где возбудитель сибирской язвы находится в вегетативной форме, не прогревают.
Бактериоскопическое исследование

ИССЛЕДОВАНИЕ МАТЕРИАЛА

ИССЛЕДОВАНИЕ МАТЕРИАЛА

ИССЛЕДОВАНИЕ МАТЕРИАЛА

После добавления аммиака

Фиксирующая жидкость состоит из 180 мл этилового спирта и 20 мл 33% пергидроля. Хранится во флаконе с притертой крышкой в темном месте.
Годна в течение месяца с момента изготовления.

3. Пробирки помещают в эксикатор, на дно которого помещают кислоту (10 мл) и соду в разных емкостях (30 г).
Эксикатор закрывают, при этом притертые поверхности краев эксикатора и крышки должны быть предварительно смазаны тонким слоем ланолина (вазелина). Эксикатор с посевами помещают в термостат при 370С.
Наклоняя эксикатор, выливаем кислоту на соду, в результате чего образуется углекислы газ.
4. Учет результатов. Через 16-20 часов инкубации из посева готовят на предметных стеклах мазки, фиксируют. Затем окрашивают одним из методов для выявления капсулы.

Споры возбудителя

4. Результаты учитывают через 5-6 часов инкубации при температуре 370С под малым увеличением (х8).
5. Окончательный учет производят через 12 - 24 часа невооруженным глазом.
6. В положительных случаях на месте нанесения капли бактериофага отмечается полный или частичный лизис колоний.

Через 18-24 часа инкубации при 370С на крышку чашки вносят несколько капель аммиака.
Большинство сибиреязвенных штаммов не способны вырабатывать фосфатазу и, следовательно, разлагать фенолфталеинфосфат натрия.
Спорообразующие сапрофиты разлагают фенолфталеинфосфат натрия с образованием индикатора фенолфталеина.
Выросшие на питательной среде колонии сибиреязвенного микроба после добавления аммиака, имеющего щелочную реакцию, остаются бесцветными, а колонии спорообразующих сапрофитов окрашиваются в розовый или красный цвет.

Приготовление среды
Во флакон с 1 млн. пенициллина добавляют 10 мл ф.р.=100000 ед./мл (флакон 1).
Титрация:
2. Содержимое из флакона 1–1,0 мл вносят в 9 мл ф.р.(флакон 2)= 10000 ед./мл;
3. Содержимое из флакона 2-1,0 мл вносят в 9,0 мл ф.р.(флакон 3)= 1000 ед./мл;
4. Из флакона 3 - 1,0 мл вносят в 9,0 мл ф.р. 9флакон 4) = 100 ед/мл
5. Из флакона 4 - 1,0 мл (100 ед.) добавляют в 100 мл среды (агар Хоттингера) и 1 мл дефибринированной крови.

Пробирки с посевами инкубируют в течение 3 часов при температуре 370С, после чего делают мазки на стекле, фиксируют жидкостью Карнуа (6 частей этилового спирта, 3 части хлороформа и 1 часть ледяной уксусной кислоты) до ее испарения, окрашивают метиленовым синим в течение 20-30 секунд и микроскопируют.
Сибиреязвенный микроб в мазках располагается в виде цепочек шарообразной формы, напоминающих ожерелье из жемчуга или бусы.
Сапрофитные бациллы на среде с пенициллином растут как обычно, в мазках наблюдаются цепочки бацилл.

ТЕСТ «ЖЕМЧУЖНОЕ ОЖЕРЕЛЬЕ»

Степень вирулентности сибиреязвенного микроба определяют в дозе, вызвавшей гибель кроликов:
высоко вирулентные штаммы вызывают гибель кроликов при введении им 10 тысяч спор.
умеренно вирулентные – при введении 100 тысяч - 1 млн спор
слабовирулентные и авирулентные штаммы не вызывают гибели кроликов в указанных дозах.

Методика постановки РНГА макрометод).
В 8 лунок полистироловой пластинки наливают по 0,4 мл разводящей жидкости (твин-80 1:100000). В первую лунку добавляют исследуемый материал и титруют переносом из лунки в лунку по 0,4 мл.
Из последней лунки лишние 0,4 мл выливают (при этом получают двукратные разведения материала).
Затем во все лунки добавляют по капле (0,03-0,05 мл) 2,5% эритроцитарного сибиреязвенного антигенного диагностикума.

После чего во все лунки добавляют по 0,2 мл сибиреязвенный антиген (входит в комплект эритроцитарного сибиреязвенного диагностикума) в рабочем разведении.
Пластинку встряхивают и помещают в термостат при 370C на 30 минут.
Затем во все лунки добавляют по 0,05 мл 2,5% антигенного сибиреязвенного эритроцитарного диагностикума.
Пластинку вновь встряхивают и выдерживают при комнатной температуре в течение 2-3 часов, после чего учитывают результат.

Из выращенной КУЛЬТУРЫ СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА ГОТОВЯТ ВЗВЕСЬ, СООТВЕТСТВУЮЩУЮ 10 ЕД. ПО СТАНДАРТУ МУТНОСТИ. ВЗВЕСЬ ГОТОВЯТ В ФИЗИОЛОГИЧЕСКОМ РАСТВОРЕ, СОДЕРЖАЩЕМ 2% ФОРМАЛИНА, КОТОРЫЙ ОБЕСПЕЧИВАЕТ ОБЕЗЗАРАЖИВАНИЕ МАТЕРИАЛА В ТЕЧЕНИЕ 2 ЧАСОВ. ИСХОДНАЯ КОНЦЕНТРАЦИЯ ИССЛЕДУЕМОЙ КУЛЬТУРЫ В РНГА – 109. М. К./ МЛ

Положительный результат – полноценная гемагглютинация, когда эритроциты выпадают на дно лунки равномерным слоем в виде зонтика, занимающего не менее 2/3 дна.
2. Отрицательный результат – отсутствие гемагглютинации, когда эритроциты выпадают на дно лунки в виде маленькой темно-коричневой пуговки или очень маленького колечка с ровным краем.

ЕСЛИ ЧИСЛО ЛУНОК С ПОЛОЖИТЕЛЬНОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИЕЙ УМЕНЬШИЛОСЬ ИЛИ ОНИ СОВСЕМ ИСЧЕЗЛИ ПО СРАВНЕНИЮ С РНГА, ТО РЕЗУЛЬТАТ РЕАКЦИИ СЧИТАЕТСЯ СПЕЦИФИЧНЫМ.
ПРИ ОТРИЦАТЕЛЬНОМ РЕЗУЛЬТАТЕ ЭРИТРОЦИТЫ В РНГА И В РТНГА ВЫПАДАЮТ НА ДНО В ВИДЕ ПУГОВКИ ИЛИ УЗКОГО КОЛЕЧКА С РОВНЫМИ КРАЯМИ.

4. Окрашивают в течение 15 минут, затем тщательно промывают водой по 10 минут в разных емкостях, 0,9% раствором хлорида натрия и подсушивают на воздухе.
5. Препараты, приготовленные непосредственно из нативного материала, окрашивают методом контрастирования.
6. С этой целью на мазок наносят смесь люминесцирующей сыворотки и бычьего альбумина, меченого родамином.
7. Смесь этих сывороток готовят в удвоенном рабочем разведении и наносят на мазок. Дальнейшую обработку проводят так же, как и при окраске люминесцирующей сывороткой.

Положительным результатом считается люминесценция клеток, оцениваемая на четыре и три креста, при наличии 2-5 светящихся клеток в каждом поле зрения.
Положительным результатом считается люминесценция клеток, оцениваемая на четыре и три креста, при наличии 2-5 светящихся клеток в каждом поле зрения.

Органы. Кусочки печени, селезенки, легких (5Х5) растирают в ступке, добавляют 2-5 мл 0,9% раствора хлорида натрия;
Смывы с поверхностей. Смывы берут с помощью стерильного ватного тампона с 5 мл дистиллированной воды. Центрифугируют при 6000 оборотах 30 минут, осадок ресуспендируют в в 0,1 мл воды;
Пробы почвы. Почву 1 г помещают с пробирку с 10 мл дистиллированной воды, перемешивают встряхиванием, дают отстояться. Надосадочную жидкость фильтруют через фильтровальную бумагу, центрифугируют при 6000 оборотах 30 минут. Осадок ресуспендируют в в 0,1 мл воды;
Далее: