Ферментные электроды. (Лекция 7)

Содержание

Слайд 2

Принцип действия и устройство ферментных электродов Основой ферментных электродов являются электрохимические

Принцип действия и устройство ферментных электродов
Основой ферментных электродов являются электрохимические датчики

(электроды):
1) Амперометрические (платиновые, золотые,
угольные электроды, кислородный электрод Кларка (из платинового катода, серебряного анода, электролита и газопроницаемой полимерной
мембраны))
2) Потенциометрические (ионоселективные электроды, например стеклянный электрод для измерения рН, газовый мембранный электрод)
Слайд 3

Датчик и фермент объединяют в единую конструкцию растворимый E или E,

Датчик и фермент объединяют в единую конструкцию
растворимый E или E, иммобилизованный

на растворимом носителе, помещают в приэлектродный слой, который отделен от остального пространства полупроницаемой мембраной.
Е иммобилизуют непосредственно на поверхности электрода
к поверхности электрода прикрепляется мембрана (целлюлозная, поликарбонатная) с ковалентно иммобилизованным Е.
к поверхности электрода прикрепляется Е в полимерной или гелевой пленке альбумина, желатина, коллагена, гидроксида алюминия.
Слайд 4

Общий вид работы ферментного электрода: молекулы субстрата диффундируют из раствора в

Общий вид работы ферментного электрода:
молекулы субстрата диффундируют из раствора в реакционный

слой

подвергаются химическим превращениям под воздействием фермента.

изменение исходной концентрации вещества, к которому селективно чувствителен электрод

изменения потенциала или тока
Слайд 5

На первой стадии происходит выравниванию локального градиента концентрации ↓ устанавливается стационарное

На первой стадии происходит выравниванию локального градиента концентрации

устанавливается стационарное состояние (скорость

ферментативной реакции равна скорости диффузии, а сигнал электрода постоянен и пропорционален скорости реакции).

Если электрод чувствителен к Р– сигнал будет увеличиваться. Если на S -сигнал будет уменьшаться
Слайд 6

Амперометрические электроды При использовании амперометрического способа регистрируется ток, проходящий через ячейку,

Амперометрические электроды
При использовании амперометрического способа регистрируется ток, проходящий через ячейку, где

находятся электрод с ферментом и электрод сравнения, на которые накладывается заданное
электрическое напряжение.
Между током (i) и концентрацией определяемого
компонента (Cx) существует вполне определенное соотношение:
Сx = f(i).
В амперометрических ферментных электродах часто применяют, Е класса оксидаз (окисление различных S кислородом).
Слайд 7

Е в режиме амперометрического биосенсора ускоряет процесс обмена электронами между S

Е в режиме амперометрического биосенсора ускоряет процесс обмена электронами между S

и электродом : 1. Перенос электронов с помощью медиатора – диффузионно-подвижного промежуточного низкомолекулярного переносчика электронов,к-рый выбирается из числа специфических субстратов фермента, проявляющих электрохимическую активность на электроде:
S +E → P + E0
E0 + M → E + M0
Электрод : M0 → M+ – e-
где E, E0 – окисленная и восстановленная формы активного центра фермента; M, M0 – окисленная и восстановленная формы медиатора
Слайд 8

2. Прямой электрокаталитический перенос электронов между электродом и активным центром фермента:

2. Прямой электрокаталитический перенос электронов между электродом и активным центром фермента:
Пример

: лакказа (Cu-содержащая оксидаза),сорбированная на электроде.
O2 + 4e- + 4H+ → 2H2O
3. Перенос электронов между активным центром фермента и доменами в полупроводнике при включении ферментов в органические полупроводники.
Амперометрические ферментные электроды применяют в медицине, в микробиологической и пищевой промышленности для опр-я концентрации глюкозы.
Слайд 9

Принцип действия ферментного электрода для измерения концентрации глю амперометрическим методом: Платиновый

Принцип действия ферментного электрода для измерения концентрации глю амперометрическим методом:
Платиновый

катод отделен от окружающей среды двухслойным покрытием.
Первый слой представляет собой мембрану с иммобилизованной глюкозооксидазой.
Второй слой сформирован тефлоновой мембраной, проницаемой для кислорода (O2 свободно диффундирует через эту мембрану и вос-
станавливается на катоде):
О2 + 2Н2О + 4е– → 4ОН-.
Слайд 10

Восстановление каждой молекулы кислорода сопровождается переносом 4 электронов. Ток, протекающий через

Восстановление каждой молекулы кислорода сопровождается переносом 4 электронов.
Ток, протекающий через

измерительную ячейку, пропорционален концентрации О2.
Если поместить электрод в раствор глюкозы, на мембране, содержащей глюкозооксидазу:
глюкоза + О2+Н2О → глюконовая кислота + Н2О2
В результате окисления глюкозы содержание кислорода в среде будет снижаться, что приведет к уменьшению стационарного тока.
Слайд 11

Потенциометрические ферментные электроды устроены аналогично амперометрическим. Отличие: с реакционным слоем контактирует

Потенциометрические ферментные электроды устроены аналогично амперометрическим. Отличие: с реакционным слоем контактирует

ионоселективный электрод, а не электрод из благородного металла.
В измерительной ячейке, где находятся ионоселективный электрод с ферментом и электрод сравнения, возникает разность потенциалов, которая зависит от активности потенциалопределяющих ионов в растворе:
E = E0+(2,3RT/nF)lga (уравнение Нернста)
Слайд 12

E = E0+(2,3RT/nF)lga (уравнение Нернста) E – разность потенциалов между ионоселективным

E = E0+(2,3RT/nF)lga (уравнение Нернста)
E – разность потенциалов между ионоселективным электродом

и электродом сравнения, мВ;
E0 – константа, зависящая в основном от
свойств электрода сравнения;
R-универсальная газовая постоянная(8.31 Дж/(моль·K))
n – заряд иона с учетом его знака;
F – постоянная Фарадея (96485,35 Кл·моль−1);
T – температура, К;
a – активность соответствующего иона (аоксис/aвосст
Слайд 13

Активность – эффективная концентрация свободных ионов в растворе. Активность и концентрация

Активность – эффективная концентрация свободных ионов в растворе. Активность и концентрация

связаны соотношением:
а = γС,
где а – активность, С – концентрация, γ – коэффициент активности. Для очень разбавленных растворов активность ионов почти равна их концентрации.
Слайд 14

Потенциометрические ферментные электроды: В качестве биокатализаторов в них выступают следующие ферменты:

Потенциометрические ферментные электроды:
В качестве биокатализаторов в них выступают следующие ферменты:
оксидазы

или декарбоксилазы аминокислот, уреаза, нитрит- и нитратредуктазы
В качестве электрохимических датчиков –
стеклянный рН-электрод, а также газовые электроды для СО2, NH3 и тд.
Слайд 15

Амперометрических по сравнению с потенциометрическими электродами: + более высокая чувствительность -

Амперометрических по сравнению с потенциометрическими электродами:
+ более высокая чувствительность
- высокий потенциал

(500–900 мВ), при котором происходит детекция, что приводит к помехам определения из-за наличия других электроактивных веществ
- у кислородоселективного электрода к не-
точностям определения могут также привести колебания в концентрации кислорода в исследуемых образцах.
Слайд 16

На время отклика (установление стационарного значения потенциала ферментного электрода) влияют :

На время отклика (установление стационарного значения потенциала ферментного электрода) влияют :

скорость перемешивания раствора (чем больше скорость, тем меньше время отклика);
• концентрация субстрата (рост концентрации приводит к уменьшению времени отклика);
• толщина ферментного слоя (чем толще слой, тем больше время отклика);
• наличие полупроницаемой защитной мембраны (увеличивает время отклика);
• условия проведения ферментативной реакции (температурный режим, рН).
Слайд 17

Стабильность ферментного электрода зависит : • способа иммобилизации фермента; • концентрации

Стабильность ферментного электрода зависит :
• способа иммобилизации фермента;
• концентрации фермента в

реакционном слое;
• толщиной ферментного слоя;
• условий проведения ферментативной реакции (температурный режим, рН).
Стабильность ферментных электродов– от нескольких дней до нескольких месяцев
Слайд 18

Использование ферментных электродов в клинической практике Методы (хроматографические, спектрофотометрические и др.),

Использование ферментных электродов в клинической практике
Методы (хроматографические, спектрофотометрические и др.), использующиеся

в клинической практике:
длительные
сложные
непригодны для быстрого анализа большого числа образцов
дорогостоящие, т.к. ферменты используются один раз и много различных реагентов.
Ферментные электроды решают эти проблемы.
Слайд 19

Преимущества ферментных электродов: • простая методика, не требующая значительных временных затрат;

Преимущества ферментных электродов:
• простая методика, не требующая значительных временных затрат;
• возможность

поточного анализа;
• высокая селективность;
• небольшое количество ферментов, необходимых для проведения анализа, и возможность их многократного использования;
• простая методика подготовки пробы.
Слайд 20

Недостатки ферментных электродов: • относительно большое время отклика, связанное с временем,

Недостатки ферментных электродов:
• относительно большое время отклика, связанное с временем, необходимым

для осуществления диффузии субстрата;
• необходимость частой градуировки электрода в связи с зависимостью чувствительности от скорости потока и влияния посторонних
химических веществ, например неорганических ионов на электродную функцию электрода.
Слайд 21

Слайд 22

Ферментные электроды используются: выявления тех или иных метаболитов; анализа ферментов сыворотки

Ферментные электроды используются:
выявления тех или иных метаболитов;
анализа ферментов сыворотки крови, представляющих

диагностическую ценность (АлАТ,АсАТ, глутаматпируваттрансаминаза и др.)
Содержание фермента оценивается косвенно, исходя из активности фермента.
Слайд 23

Глутаматпируваттрансаминаза катализирует реакцию: L-аланин + α-кетоглутаровая килота → L-глутаминовая кислота +

Глутаматпируваттрансаминаза катализирует реакцию:
L-аланин + α-кетоглутаровая килота →
L-глутаминовая кислота + ПВК
Кислородный

электрод с иммобилизованной оксидазой ПВК, который и определяет его количество.
Слайд 24

Иммуноферментные электроды К кислород-проницаемой тефлоновой пленке кислородного электрода Кларка плотно прилегает

Иммуноферментные электроды
К кислород-проницаемой тефлоновой пленке кислородного электрода Кларка плотно
прилегает мембрана не

с иммобилизованным ферментом, а с иммобилизованными антителами к анализируемому антигену.
Слайд 25

В раствор, содержащий анализируемый антиген, добавляют определенное количество антигенов, предварительно меченных

В раствор, содержащий анализируемый антиген, добавляют определенное количество антигенов, предварительно меченных

каталазой.

Иммуноферментный электрод погружают в исследуемый раствор и выдерживают при нужной температуре в течение необходимого времени.

Меченые и немеченые антигены, конкурируя между собой, связываются с антителами на поверхности электрода.
Слайд 26

Удаляют свободные антигены, путем промывки иммуноферментного электрода ↓ Добавляют в исследуемый

Удаляют свободные антигены, путем промывки иммуноферментного электрода

Добавляют в исследуемый раствор пероксид

водорода

По сигналу электрода определяют скорость образования кислорода в результате катализируемой каталазой реакции :
H2O2 → H2O + 1/2O2

Строят кривую зависимости сигнала от числа немеченых антигенов.
Слайд 27

Аналитические проточные реакторы с иммобилизованными ферментами Для анализа метаболитов и ферментов

Аналитические проточные реакторы
с иммобилизованными ферментами
Для анализа метаболитов и ферментов в клинической

и лабораторной практике достаточно широко используются аналитические проточные реакторы с иммобилизованными ферментами.
Пример: определение триптофана
В колонке иммобилизованы E: триптофаназа и лактатдегидрогеназа
триптофан + пиридоксальфосфат →
индол + NH3 +ПВК;
ПВК+ НАДН2 → молочная кислота + НАД.
Детекция убыли НАДН на 360 нм
Слайд 28

Ферментные микрокалориметрические датчики Две идентичные колонки ,заполненных носителем с иммобилизованным на

Ферментные микрокалориметрические датчики
Две идентичные колонки ,заполненных носителем с иммобилизованным на нем

E.
В нижней части каждой из колонок имеется термистор.
При пропускании через колонки простого буфера разность t◦ между термисторами будет равна нулю.
При введении в одну из колонок S в результате ферментативной реакции произойдет тепловыделение.
Разность t◦ между измерительной колонкой и колонкой сравнения будет пропорциональна количеству превращенного S.
Слайд 29

Слайд 30

Слайд 31

Слайд 32

Слайд 33

Слайд 34

Слайд 35

Слайд 36

Слайд 37