Ферментные электроды. (Лекция 7)

Июль 22, 2022

Главная
Биология
Ферментные электроды. (Лекция 7)

Содержание

2. Принцип действия и устройство ферментных электродов Основой ферментных электродов являются электрохимические датчики (электроды): 1) Амперометрические (платиновые,
3. Датчик и фермент объединяют в единую конструкцию растворимый E или E, иммобилизованный на растворимом носителе, помещают
4. Общий вид работы ферментного электрода: молекулы субстрата диффундируют из раствора в реакционный слой ↓ подвергаются химическим
5. На первой стадии происходит выравниванию локального градиента концентрации ↓ устанавливается стационарное состояние (скорость ферментативной реакции равна
6. Амперометрические электроды При использовании амперометрического способа регистрируется ток, проходящий через ячейку, где находятся электрод с ферментом
7. Е в режиме амперометрического биосенсора ускоряет процесс обмена электронами между S и электродом : 1. Перенос
8. 2. Прямой электрокаталитический перенос электронов между электродом и активным центром фермента: Пример : лакказа (Cu-содержащая оксидаза),сорбированная
9. Принцип действия ферментного электрода для измерения концентрации глю амперометрическим методом: Платиновый катод отделен от окружающей среды
10. Восстановление каждой молекулы кислорода сопровождается переносом 4 электронов. Ток, протекающий через измерительную ячейку, пропорционален концентрации О2.
11. Потенциометрические ферментные электроды устроены аналогично амперометрическим. Отличие: с реакционным слоем контактирует ионоселективный электрод, а не электрод
12. E = E0+(2,3RT/nF)lga (уравнение Нернста) E – разность потенциалов между ионоселективным электродом и электродом сравнения, мВ;
13. Активность – эффективная концентрация свободных ионов в растворе. Активность и концентрация связаны соотношением: а = γС,
14. Потенциометрические ферментные электроды: В качестве биокатализаторов в них выступают следующие ферменты: оксидазы или декарбоксилазы аминокислот, уреаза,
15. Амперометрических по сравнению с потенциометрическими электродами: + более высокая чувствительность - высокий потенциал (500–900 мВ), при
16. На время отклика (установление стационарного значения потенциала ферментного электрода) влияют : • скорость перемешивания раствора (чем
17. Стабильность ферментного электрода зависит : • способа иммобилизации фермента; • концентрации фермента в реакционном слое; •
18. Использование ферментных электродов в клинической практике Методы (хроматографические, спектрофотометрические и др.), использующиеся в клинической практике: длительные
19. Преимущества ферментных электродов: • простая методика, не требующая значительных временных затрат; • возможность поточного анализа; •
20. Недостатки ферментных электродов: • относительно большое время отклика, связанное с временем, необходимым для осуществления диффузии субстрата;
22. Ферментные электроды используются: выявления тех или иных метаболитов; анализа ферментов сыворотки крови, представляющих диагностическую ценность (АлАТ,АсАТ,
23. Глутаматпируваттрансаминаза катализирует реакцию: L-аланин + α-кетоглутаровая килота → L-глутаминовая кислота + ПВК Кислородный электрод с иммобилизованной
24. Иммуноферментные электроды К кислород-проницаемой тефлоновой пленке кислородного электрода Кларка плотно прилегает мембрана не с иммобилизованным ферментом,
25. В раствор, содержащий анализируемый антиген, добавляют определенное количество антигенов, предварительно меченных каталазой. ↓ Иммуноферментный электрод погружают
26. Удаляют свободные антигены, путем промывки иммуноферментного электрода ↓ Добавляют в исследуемый раствор пероксид водорода ↓ По
27. Аналитические проточные реакторы с иммобилизованными ферментами Для анализа метаболитов и ферментов в клинической и лабораторной практике
28. Ферментные микрокалориметрические датчики Две идентичные колонки ,заполненных носителем с иммобилизованным на нем E. В нижней части
39. Скачать презентацию

Слайд 2

Принцип действия и устройство ферментных электродов
Основой ферментных электродов являются электрохимические датчики

(электроды):
1) Амперометрические (платиновые, золотые,
угольные электроды, кислородный электрод Кларка (из платинового катода, серебряного анода, электролита и газопроницаемой полимерной
мембраны))
2) Потенциометрические (ионоселективные электроды, например стеклянный электрод для измерения рН, газовый мембранный электрод)

Слайд 3

Датчик и фермент объединяют в единую конструкцию
растворимый E или E, иммобилизованный

на растворимом носителе, помещают в приэлектродный слой, который отделен от остального пространства полупроницаемой мембраной.
Е иммобилизуют непосредственно на поверхности электрода
к поверхности электрода прикрепляется мембрана (целлюлозная, поликарбонатная) с ковалентно иммобилизованным Е.
к поверхности электрода прикрепляется Е в полимерной или гелевой пленке альбумина, желатина, коллагена, гидроксида алюминия.

Слайд 4

Общий вид работы ферментного электрода:
молекулы субстрата диффундируют из раствора в реакционный

слой
↓
подвергаются химическим превращениям под воздействием фермента.
↓
изменение исходной концентрации вещества, к которому селективно чувствителен электрод
↓
изменения потенциала или тока

Слайд 5

На первой стадии происходит выравниванию локального градиента концентрации
↓
устанавливается стационарное состояние (скорость

ферментативной реакции равна скорости диффузии, а сигнал электрода постоянен и пропорционален скорости реакции).
↓
Если электрод чувствителен к Р– сигнал будет увеличиваться. Если на S -сигнал будет уменьшаться

Слайд 6

Амперометрические электроды
При использовании амперометрического способа регистрируется ток, проходящий через ячейку, где

находятся электрод с ферментом и электрод сравнения, на которые накладывается заданное
электрическое напряжение.
Между током (i) и концентрацией определяемого
компонента (Cx) существует вполне определенное соотношение:
Сx = f(i).
В амперометрических ферментных электродах часто применяют, Е класса оксидаз (окисление различных S кислородом).

Слайд 7

Е в режиме амперометрического биосенсора ускоряет процесс обмена электронами между S

и электродом : 1. Перенос электронов с помощью медиатора – диффузионно-подвижного промежуточного низкомолекулярного переносчика электронов,к-рый выбирается из числа специфических субстратов фермента, проявляющих электрохимическую активность на электроде:
S +E → P + E0
E0 + M → E + M0
Электрод : M0 → M+ – e-
где E, E0 – окисленная и восстановленная формы активного центра фермента; M, M0 – окисленная и восстановленная формы медиатора

Слайд 8

2. Прямой электрокаталитический перенос электронов между электродом и активным центром фермента:
Пример

: лакказа (Cu-содержащая оксидаза),сорбированная на электроде.
O2 + 4e- + 4H+ → 2H2O
3. Перенос электронов между активным центром фермента и доменами в полупроводнике при включении ферментов в органические полупроводники.
Амперометрические ферментные электроды применяют в медицине, в микробиологической и пищевой промышленности для опр-я концентрации глюкозы.

Слайд 9

Принцип действия ферментного электрода для измерения концентрации глю амперометрическим методом:
Платиновый

катод отделен от окружающей среды двухслойным покрытием.
Первый слой представляет собой мембрану с иммобилизованной глюкозооксидазой.
Второй слой сформирован тефлоновой мембраной, проницаемой для кислорода (O2 свободно диффундирует через эту мембрану и вос-
станавливается на катоде):
О2 + 2Н2О + 4е– → 4ОН-.

Слайд 10

Восстановление каждой молекулы кислорода сопровождается переносом 4 электронов.
Ток, протекающий через

измерительную ячейку, пропорционален концентрации О2.
Если поместить электрод в раствор глюкозы, на мембране, содержащей глюкозооксидазу:
глюкоза + О2+Н2О → глюконовая кислота + Н2О2
В результате окисления глюкозы содержание кислорода в среде будет снижаться, что приведет к уменьшению стационарного тока.

Слайд 11

Потенциометрические ферментные электроды устроены аналогично амперометрическим. Отличие: с реакционным слоем контактирует

ионоселективный электрод, а не электрод из благородного металла.
В измерительной ячейке, где находятся ионоселективный электрод с ферментом и электрод сравнения, возникает разность потенциалов, которая зависит от активности потенциалопределяющих ионов в растворе:
E = E0+(2,3RT/nF)lga (уравнение Нернста)

Слайд 12

E = E0+(2,3RT/nF)lga (уравнение Нернста)
E – разность потенциалов между ионоселективным электродом

и электродом сравнения, мВ;
E0 – константа, зависящая в основном от
свойств электрода сравнения;
R-универсальная газовая постоянная(8.31 Дж/(моль·K))
n – заряд иона с учетом его знака;
F – постоянная Фарадея (96485,35 Кл·моль−1);
T – температура, К;
a – активность соответствующего иона (аоксис/aвосст

Слайд 13

Активность – эффективная концентрация свободных ионов в растворе. Активность и концентрация

связаны соотношением:
а = γС,
где а – активность, С – концентрация, γ – коэффициент активности. Для очень разбавленных растворов активность ионов почти равна их концентрации.

Слайд 14

Потенциометрические ферментные электроды:
В качестве биокатализаторов в них выступают следующие ферменты:
оксидазы

или декарбоксилазы аминокислот, уреаза, нитрит- и нитратредуктазы
В качестве электрохимических датчиков –
стеклянный рН-электрод, а также газовые электроды для СО2, NH3 и тд.

Слайд 15

Амперометрических по сравнению с потенциометрическими электродами:
+ более высокая чувствительность
- высокий потенциал

(500–900 мВ), при котором происходит детекция, что приводит к помехам определения из-за наличия других электроактивных веществ
- у кислородоселективного электрода к не-
точностям определения могут также привести колебания в концентрации кислорода в исследуемых образцах.

Слайд 16

На время отклика (установление стационарного значения потенциала ферментного электрода) влияют :
•

скорость перемешивания раствора (чем больше скорость, тем меньше время отклика);
• концентрация субстрата (рост концентрации приводит к уменьшению времени отклика);
• толщина ферментного слоя (чем толще слой, тем больше время отклика);
• наличие полупроницаемой защитной мембраны (увеличивает время отклика);
• условия проведения ферментативной реакции (температурный режим, рН).

Слайд 17

Стабильность ферментного электрода зависит :
• способа иммобилизации фермента;
• концентрации фермента в

реакционном слое;
• толщиной ферментного слоя;
• условий проведения ферментативной реакции (температурный режим, рН).
Стабильность ферментных электродов– от нескольких дней до нескольких месяцев

Слайд 18

Использование ферментных электродов в клинической практике
Методы (хроматографические, спектрофотометрические и др.), использующиеся

в клинической практике:
длительные
сложные
непригодны для быстрого анализа большого числа образцов
дорогостоящие, т.к. ферменты используются один раз и много различных реагентов.
Ферментные электроды решают эти проблемы.

Слайд 19

Преимущества ферментных электродов:
• простая методика, не требующая значительных временных затрат;
• возможность

поточного анализа;
• высокая селективность;
• небольшое количество ферментов, необходимых для проведения анализа, и возможность их многократного использования;
• простая методика подготовки пробы.

Слайд 20

Недостатки ферментных электродов:
• относительно большое время отклика, связанное с временем, необходимым

для осуществления диффузии субстрата;
• необходимость частой градуировки электрода в связи с зависимостью чувствительности от скорости потока и влияния посторонних
химических веществ, например неорганических ионов на электродную функцию электрода.

Слайд 21

Слайд 22

Ферментные электроды используются:
выявления тех или иных метаболитов;
анализа ферментов сыворотки крови, представляющих

диагностическую ценность (АлАТ,АсАТ, глутаматпируваттрансаминаза и др.)
Содержание фермента оценивается косвенно, исходя из активности фермента.

Слайд 23

Глутаматпируваттрансаминаза катализирует реакцию:
L-аланин + α-кетоглутаровая килота →
L-глутаминовая кислота + ПВК
Кислородный

электрод с иммобилизованной оксидазой ПВК, который и определяет его количество.

Слайд 24

Иммуноферментные электроды
К кислород-проницаемой тефлоновой пленке кислородного электрода Кларка плотно
прилегает мембрана не

с иммобилизованным ферментом, а с иммобилизованными антителами к анализируемому антигену.

Слайд 25

В раствор, содержащий анализируемый антиген, добавляют определенное количество антигенов, предварительно меченных

каталазой.
↓
Иммуноферментный электрод погружают в исследуемый раствор и выдерживают при нужной температуре в течение необходимого времени.
↓
Меченые и немеченые антигены, конкурируя между собой, связываются с антителами на поверхности электрода.

Слайд 26

Удаляют свободные антигены, путем промывки иммуноферментного электрода
↓
Добавляют в исследуемый раствор пероксид

водорода
↓
По сигналу электрода определяют скорость образования кислорода в результате катализируемой каталазой реакции :
H2O2 → H2O + 1/2O2
↓
Строят кривую зависимости сигнала от числа немеченых антигенов.

Слайд 27

Аналитические проточные реакторы
с иммобилизованными ферментами
Для анализа метаболитов и ферментов в клинической

и лабораторной практике достаточно широко используются аналитические проточные реакторы с иммобилизованными ферментами.
Пример: определение триптофана
В колонке иммобилизованы E: триптофаназа и лактатдегидрогеназа
триптофан + пиридоксальфосфат →
индол + NH3 +ПВК;
ПВК+ НАДН2 → молочная кислота + НАД.
Детекция убыли НАДН на 360 нм

Слайд 28

Ферментные микрокалориметрические датчики
Две идентичные колонки ,заполненных носителем с иммобилизованным на нем

E.
В нижней части каждой из колонок имеется термистор.
При пропускании через колонки простого буфера разность t◦ между термисторами будет равна нулю.
При введении в одну из колонок S в результате ферментативной реакции произойдет тепловыделение.
Разность t◦ между измерительной колонкой и колонкой сравнения будет пропорциональна количеству превращенного S.

Слайд 29

Слайд 30

Слайд 31

Слайд 32

Слайд 33

Слайд 34

Слайд 35

Слайд 36

Слайд 37

Ферментные электроды. (Лекция 7)

Содержание

Принцип действия и устройство ферментных электродовОсновой ферментных электродов являются электрохимические датчики

Датчик и фермент объединяют в единую конструкциюрастворимый E или E, иммобилизованный

Общий вид работы ферментного электрода:молекулы субстрата диффундируют из раствора в реакционный

На первой стадии происходит выравниванию локального градиента концентрации↓устанавливается стационарное состояние (скорость

Амперометрические электродыПри использовании амперометрического способа регистрируется ток, проходящий через ячейку, где

Е в режиме амперометрического биосенсора ускоряет процесс обмена электронами между S

2. Прямой электрокаталитический перенос электронов между электродом и активным центром фермента:Пример

Принцип действия ферментного электрода для измерения концентрации глю амперометрическим методом: Платиновый

Восстановление каждой молекулы кислорода сопровождается переносом 4 электронов. Ток, протекающий через

Потенциометрические ферментные электроды устроены аналогично амперометрическим. Отличие: с реакционным слоем контактирует

E = E0+(2,3RT/nF)lga (уравнение Нернста)E – разность потенциалов между ионоселективным электродом

Активность – эффективная концентрация свободных ионов в растворе. Активность и концентрация

Потенциометрические ферментные электроды:В качестве биокатализаторов в них выступают следующие ферменты: оксидазы

Амперометрических по сравнению с потенциометрическими электродами:+ более высокая чувствительность- высокий потенциал

На время отклика (установление стационарного значения потенциала ферментного электрода) влияют :•

Стабильность ферментного электрода зависит :• способа иммобилизации фермента;• концентрации фермента в

Использование ферментных электродов в клинической практикеМетоды (хроматографические, спектрофотометрические и др.), использующиеся

Преимущества ферментных электродов:• простая методика, не требующая значительных временных затрат;• возможность

Недостатки ферментных электродов:• относительно большое время отклика, связанное с временем, необходимым

Ферментные электроды используются:выявления тех или иных метаболитов;анализа ферментов сыворотки крови, представляющих

Глутаматпируваттрансаминаза катализирует реакцию:L-аланин + α-кетоглутаровая килота → L-глутаминовая кислота + ПВККислородный

Иммуноферментные электродыК кислород-проницаемой тефлоновой пленке кислородного электрода Кларка плотноприлегает мембрана не