Разработка препаративных методик получения фосфатсодержащих производных бетулина с улучшенной растворимостью в воде

сырья, обладают рядом ценных фармакологически активных свойств:

Существенными преимуществами бетулина и его производных являются:

Онкопротекторными;

Иммуностимулирующим и др.

Гепатопротекторными;

Антиоксидантными;

Антивирусными;

Противоспалительными;

1

2

3

4

5

6

1

Очень низкая токсичность;

2

Возобновляемость природных ресурсов, являющихся наиболее предпочтительным источником бетулина и его производных.

3

Преимущество фосфатсодержащих производных бетулина: высокая растворимость в воде, и как следствие – высокая биодоступность и благоприятная биотрансформация (фосфатазы, киназы и др.) в организме человека.

состоящей из четырех
шестичленных циклов в форме «кресла» и одного пятичленного цикла в
форме «полукресла» (13С- и 1Н-ЯМР-спектроскопия)

Склонность к изомеризации:
• внутримолекулярная миграция метильных групп и атомов водорода;
• смещение кратной связи С-20=С-29 → С-20=С-19 → С-19=С-18;
• эпимеризация (α- и β-эпимеры при атоме углерода С-3).

Наличие в молекуле бетулина трёх реакционных центров:
• первичная спиртовая группа при углеродном атоме С-28;
• вторичная спиртовая группа при углеродном атоме С-3;
• кратная связь при С-20=С-29.

Низкая селективность фосфорилирования;

4

Способность к образованию структурных модификаций (явление полиморфизма);

7

Чрезвычайно низкая растворимость бетулина и большинства его производных в воде.

БЕТУЛИН

СЛОЖНОСТЬ ФУНКЦИОНАЛИЗАЦИИ БЕТУЛИНА
ОБУСЛОВЛЕНА РЯДОМ ФАКТОРОВ

улучшенной растворимостью в воде.

ФОРМУЛИРОВКА ЦЕЛИ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОЙ РАБОТЫ
И ПОСТАНОВКА ОСНОВНЫХ ЗАДАЧ

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОЙ РАБОТЫ:

ЗАДАЧИ:

1

Модификация препаративного синтеза аллобетулина;

Разработка синтеза 3β-фосфата аллобетулина;

Оптимизация синтеза структурной модификации 3β,28-дифосфата бетулина с улучшенной растворимостью в воде;

Разработка методов стабилизации 3β,28-дифосфата бетулина в нужной структурной модификации.

2

3

4

пиридиний-хлоридные комплексы ОТКУДА ВЗЯЛСЯ ПИРИДИН!?
** Предварительное удаление пиридиний-хлоридного комплекса с помощью фильтрации.

М

М

!

при атоме С-3 бетулина (3JH-P ~8 Hz – СН-О-Р);
Триплет δ = +0,48 м.д. – фосфатная группа при атоме С-28 бетулина (3JH-P ~4.6 Hz – СН2-О-Р);
Синглет δ = -0,27 м.д. – неорганический фосфат (стандарт 1);
Мультиплет δ = -5.93 м.д. - Ph3P (стандарт 2) – отсутствует на представленном фрагменте 31Р-ЯМР-спектра 3β,28-дифосфата бетулина.

ЯМР-спектрометр «Bruker AM500» (Bruker Daltonik GmbH, Germany) в Растворитель - DMSO-d6;
Стандарт 1 – Н3РО4;
Стандарт 2 – Ph3P.

ДОКАЗАТЕЛЬСТВО СТРУКТУРЫ 3β,28-ДИФОСФАТА БЕТУЛИНА
С ПОМОЩЬЮ 31Р-ЯМР-СПЕКТРОСКОПИИ

3β,28-ДИФОСФАТ
БЕТУЛИНА

С28Н2-О-Р

С3Н-О-Р

Н3РО4

0.68-1.99 м.д. (42H, м, 6CH3, (CH2)10, (CH)4), 2.35-2.42 м.д. (1H, м, H-19), 2.97 м.д. (0.25Н, шир. т, α-Н-3, J = 7.7 Гц), 3.69 м.д. (0.75H, ддд, β-H-3 м J = 4.6, 7.8, 11.2 Гц), 3.96 м.д. (1Н, дд, H-28, J = 9.7, 4.5 Гц) и 3.52 м.д. (Н, дд, H-28’, J = 9.5, 4.5 Гц), 4.55, 4.69 м.д. (2Н, два с, H-29), 5.69 (протоны в фосфатных группах О-Р(O)(ОН)2, шир. размытый с).

ЯМР: 1H-ЯМР

ЭПИМЕРИЗАЦИЯ 3β,28-ДФБ

МУЛЬТИПЛЕТ
(ТРИПЛЕТ ДУБЛЕТОВ)

ШИРОКИЙ
ТРИПЛЕТ

β –ЭПИМЕР 3β,28-ДИФОСФАТА БЕТУЛИНА

(С-20), 79,1 (С-28), 109,7 (С-29)

13С-ЯМР

ЭПИМЕРИЗАЦИЯ 3β,28-ДФБ

В ВОДЕ

3β,28-ДИФОСФАТ(V)
БЕТУЛИНА

ИОННЫЙ КОМПЛЕКС
3β,28-ДИФОСФАТА БЕТУЛИНА С МЕГЛУМИНОМ

меглумином

ИССЛЕДОВАНИЕ СОЛЕВОГО КОМПЛЕКСА
3β,28-ДИФОСФАТА БЕТУЛИНА С МЕГЛУМИНОМ
C ПОМОЩЬЮ 31P-ЯМР-СПЕКТРОСКОПИИ

ИОННЫЙ КОМПЛЕКС
3β,28-ДИФОСФАТА БЕТУЛИНА С МЕГЛУМИНОМ (1 : 4)

H+: пиридин
Растворитель: 1,4-диоксан
~ 24 ч
Нормальные условия

ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ АЛЛОБЕТУЛИНА

при атоме Сβ-3 аллобетулина.

ЯМР-спектрометр «Bruker AM500» (Bruker Daltonik GmbH, Germany) в DMSO-d6, стандарт – Ph3P

ДОКАЗАТЕЛЬСТВО СТРУКТУРЫ 3β -ФОСФАТА АЛЛОБЕТУЛИНА

3β-ФОСФАТ АЛЛОБЕТУЛИНА

31P-ЯМР

TMS, 400 МГц).
δ 0,75 - 1,03 м.д. (6с, 21Н, 7CH3); 1,20-1,90 м.д. (м, 24H, СН2, СН); 3,67-3,73 м.д. (м, 1Н, Н-3); 3,32 м.д. (д, 1Н, H-28); 3,61 м.д. (д, 1Н, H’-28); 3,39 м.д. (с, 1Н, H-19).

Н-3

Н’-28

Н-28

Н-19

ЯМР-спектрометр «Bruker AM500» (Bruker Daltonik GmbH, Germany) в DMSO-d6, стандарт – Ph3P

3β-ФОСФАТ АЛЛОБЕТУЛИНА

Сравнительные данные 1Н-ЯМР-спектра аллобетулина (CDCl3, стандарт TMS, 400 МГц ).
δ 0,75 м.д. - 1,03 (6с, 21Н, 7CH3); 1,20-1,90 м.д. (м, СН2 ,СН); 3,22 м.д. (м, 1Н, Н-3); 3,49 м.д.(д, 1Н, Н-28); 3,76 м.д. (д, 1Н, Н’-28); 3,53 м.д. (с,1Н,с, Н-19).

отличались в области «отпечатков пальцев» (890-400 см-1), а также в области, соответствующей валентным колебаниям фосфорильных – Р-О st, Р=О st (1800-1580; 1290-1190 см-1), и гидроксильных – ОН st (3400-3300 см-1) групп.

Аллобетулин

3β-Фосфат
аллобетулина

Область «отпечатка пальцев»

импрегнированной на силикагель.
Разработан синтез 3β-фосфата аллобетулина путем фосфорилирования аллобетулина оксихлоридом фосфора с последующим гидролизом фосфодихлоридного производного;
Модифицирована препаративная методика получения онкопротекторного соединения – 3β,28-дифосфата бетулина, в виде структурной модификации 1, растворимость в воде которой практически в десять раз больше, чем у структурной модификации 2;
Предложены методы стабилизации 3β,28-дифосфата бетулина в нужной структурной модификации. Показано, что оптимальной стабильной формой 3β,28-дифосфата бетулина является его двойная соль с меглумином, растворимость которой в воде увеличивается в 600 раз по сравнению с исходным 3β,28-дифосфатом бетулина и в 60 · 106 раз по сравнению с исходным бетулином!

ВЫВОДЫ

1

2

3

4

(42H, м, 6CH3, (CH2)10, (CH)4), 2.35-2.42 м.д. (1H, м, H-19), 2.97 м.д. (0.25Н, шир. т, α-Н-3, J = 7.7 Гц), 3.69 м.д. (0.75H, ддд, β-H-3 м J = 4.6, 7.8, 11.2 Гц), 3.96 м.д. (1Н, дд, H-28, J = 9.7, 4.5 Гц) и 3.52 м.д. (Н, дд, H-28’, J = 9.5, 4.5 Гц), 4.55, 4.69 м.д. (2Н, два с, H-29), 5.69 (протоны в фосфатных группах О-Р(O)(ОН)2, шир. размытый с).

3β,28-ДФБ в различных средах:
а) в 95% этаноле (11); в 4,0∙10-3М водном растворе NaOH (12); в 0,02М этанольном растворе H2SO4 (13). C3β,28-ДФБ = 1,0·10-3M.
б) в водных растворах с меглумином C3β,28-ДФБ = 5,0·10-4M, CLiClO4 = 1,0·10-2M;
в) зависимость поглощения A256 от молярного соотношения меглумина к 3β,28-ДФБ, А = f(αмегл), αмегл = nмегл / n3β,28-ДФБ (оптимум при αмегл = 2).

(а)

(б)

(в)

Оптимальное
значение αмегл

а также в области, отвечающей валентным колебаниям фосфорильных – Р-О-Н comb (2331, 2342 см-1 широкая слабая полоса), Р-О st, Р=О st (1216-1196; 1100-940 см-1), и гидроксильных групп – 3400-3300 см-1.

3, 28-ДФБ-1

3,28-ДФБ-2

ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНЫХ МОДИФИКАЦИЙ 3β,28-ДФБ
С ПОМОЩЬЮ МЕТОДОВ КОЛЕБАТЕЛЬНОЙ ИК-СПЕКТРОСКОПИИ