Транскрипция ДНК и РНК

ГЕН

Законы Менделя

1. Закон единообразия гибридов первого поколения
У потомков первого поколения от

ГЕН

Законы Менделя

3. Закон независимого наследования признаков
Варианты одного признака проявляются в потомстве

ГЕН

Streptococcus pneumoniae

Эксперимент Гриффита (1928)

Тип S

Тип R

Трансформация
бактерий

ГЕН

Эксперимент Херши-Чейз (1952)

Мечение 32P
(метится ДНК)

Мечение 35S
(метится белок)

Метка
в осадке
(в бактериях)

Метка
в супернатанте
(в вирусах)

Центрифугирование

Инфицирование

ГЕН

Единица наследственности (и мутагенеза) – ограниченный в пространстве участок генома (ДНК

Цистрон

Цистрон – локус генома (участок ДНК),
ответственный за образование белка (РНК)

Цистрон А

Цистрон

cis-элементы, trans-элементы и trans-факторы

+1

+1

+1

+1

Транскрипт

сis-элемент

сis-элемент – участок той же молекулы ДНК, с

cis-элементы, trans-элементы и trans-факторы

Транскрипт

trans-элемент

+1

+1

+1

+1

trans-элемент – участок молекулы ДНК, с которой не

cis-элементы, trans-элементы и trans-факторы

Фактор – молекула неДНКовой природы, влияющая на транскрипцию

Транскрипт

Транскрипция

Промотор

+1

5’-нетранскрибируемый
Участок ДНК

Промотор

Промотор обеспечивает
корректное начало и направление транскрипции

Удаление промотора
приводит к сильному подавлению

Цистрон

Промотор

Терминатор

cis-элементы

РНК А

РНК Б

РНК В

Цистрон А

Цистрон Б

Цистрон В

Цистрон окружен cis-элементами, необходимыми для

Генетическая регуляция синтеза ферментов,
информационная РНК и оперон

Оперон

Оперон – локус генома (участок ДНК),
ответственный за образование нескольких белков (РНК)

Lac-оперон

D-Глюкоза

Основной источник энергии для бактерий

Лактоза

β-галактозид пермеаза – обеспечивает проникновени лактозы

Lac-оперон

Промотор

Терминатор

Оператор (cis-элемент)

LacZ

LacY

LacA

LacY – кодирует β-галактозид пермеазу
LacZ – кодирует β-галактозидазу
LacA

ТРАНСКРИПЦИЯ
реализация генетической информации

Транскрипция

АТФ
УТФ
ГТФ
ЦТФ

матрица ДНК

матрица ДНК + РНК

РНК-полимераза (трансфераза)

4xPPi

дАТФ
дТТФ
дГТФ
дЦТФ

матрица РНК

матрица РНК + ДНК

ДНК-полимераза (трансфераза)

4xPPi

ДНК-зависимая

Транскрипция

РНК-полимераза

Нобелевская премия 1959 г.
«За открытие механизмов биосинтеза рибонуклеиновой кислоты и дезоксирибонуклеиновой

Транскрипция

РНК-полимераза

Фракция, обогащенная белком

Экстракт ткани

Добавляем фракцию, обогащенную белком

Добавляем радиоактивно меченные рибонуклеотиды

Инкубируем

В растворе

Удаляем
нуклеотиды

Транскрипция

РНК-полимераза

Добавляем фракцию, обогащенную белком

Добавляем радиоактивно меченные рибонуклеотиды

Инкубируем

Радиоактивность в растворе
не обнаруживается

Удаляем
нуклеотиды

Обрабатываем
ДНКазой

Обрабатываем
РНКазой

В растворе

Транскрипция

РНК-полимераза

Добавляем фракцию, обогащенную белком

Добавляем радиоактивно меченные рибонуклеотиды

Инкубируем

Обрабатываем
ДНКазой

Обрабатываем
РНКазой

Радиоактивность в растворе
не обнаруживается

В растворе

Транскрипция

РНК-полимераза

(NМФ)n + NТФ

(NМФ)n+1 + PPi

РНК-полимераза

ДНК-матрица

ДНК-матрица

РНК

РНК-полимераза требует наличия матрицы (ДНК).
РНК-полимераза присоединяет рибонуклеозидмонофосфат в соответствии с правилом

РНК-полимераза работает только на одноцепочечной ДНК

Для работы РНК-полимеразы требуется
локальное плавление двухцепочечной

Антимысловая цепь ДНК (ген Б)

Антисмысловая цепь ДНК (ген А)

Небольшое отступление

Смысловая и

Антимысловая цепь ДНК (ген Б)

Антисмысловая цепь ДНК (ген А)

Небольшое отступление

Смысловая и

РНК-полимераза

РНК-полимераза присоединяет рибонуклеотидмонофосфат
к 3’-ОН группе рибозы

Цепь РНК растет в направлении 5’-3’
Матрицей

РНК-полимераза

РНК-полимераза – белок с четвертичной структурой

Транскрипция

β

β’

αI

αII

ω

Бактериальная РНК-полимераза

состоит из 6 субъединиц –

РНК-полимеразы

Транскрипция

Эукариоты

РНК-полимераза бактерий

РНК-полимераза I

РНК-полимераза II

РНК-полимераза III

РНК-полимераза IVa

РНК-полимераза IVb

РНК-полимераза архей

РНК-полимераза вирусов
(У бактериофагов -

РНК-полимераза

РНК-полимераза работает только на определенных участках ДНК

Транскрипция

ДНК

5’-нетранскрибируемый
участок ДНК

3’-нетранскрибируемый
участок ДНК

Транскрибируемый
участок ДНК

Точка начала

Транскрипция

Этапы транскрипции

Инициация
Элонгация РНК
Терминация

Транскрипция

Инициация транскрипции у бактерий

Промоторные cis-элементы бактерий

+1

Бокс Прибноу-Шаллера, 1975 (элемент -10)

-10 п.н.

Вероятность
присутствия
нуклеотида

РНК-пол

РНК-пол

Обработка

Транскрипция

Инициация транскрипции у бактерий

Промоторные cis-элементы бактерий

+1

Бокс Гилберта, 1976 (элемент -35)

-10 п.н.

-35

Транскрипция

Инициация транскрипции у бактерий

1. РНК-полимераза связывается с ДНК

2. РНК-полимераза «ищет» промотор

3.

Транскрипция

Инициация транскрипции у бактерий

6. РНК-полимераза включает несколько первых нуклеотидов

4. РНК-полимераза плавит

РНК-полимераза I

РНК-полимераза II

РНК-полимераза III

Ядерные РНК-полимеразы

Транскрипция

Рибосомная РНК
45S рРНК
28S рРНК
18S рРНК
5.8S рРНК

мРНК

тРНК

5S рРНК

Гены

Транскрипция

РНК-полимераза II

С-концевой домен
РНК-полимеразы II (CTD)

РНК-полимераза II

состоит из 12 субъединиц
молекулярный вес ~550

Ковалентные модификации белков

Протеинкиназа
(трансфераза)

Фосфорилирование

Ковалентные модификации белков

Ацетилаза
(трансфераза)

Ацетилирование

Ковалентные модификации белков

-

+

-

Ацетилирование

Транскрипция

Инициация транскрипции у эукариот

Общие факторы инициации транскрипции РНК-полимеразы II

TFIIA – 3

Транскрипция

Инициация транскрипции у эукариот

Промоторы генов II класса

ТАТА-бокс (бокс Голдберга-Хогнеса, 1978)

+1

Инициатор (Inr)

-2

+4

~

Транскрипция

Инициация транскрипции у эукариот

Связывание базальных факторов транскрипции с промотором

TFIID = TBP

TFIID

Транскрипция

Инициация транскрипции у эукариот

Связывание базальных факторов транскрипции с промотором

TFIIA

TFIIB

TATA

Inr

TFIIA

TFIIB

+1

Шаг 2. TFIIA

TFIID

Транскрипция

Инициация транскрипции у эукариот

Связывание базальных факторов транскрипции и РНК-полимеразы
с промотором

TATA

TFIIA

Шаг 3.

Транскрипция

Инициация транскрипции у эукариот

Начало транскрипции

Шаг 4(а). TFIIH плавит ДНК, TFIIE стабилизирует

Транскрипция

Инициация транскрипции у эукариот

Шаг 5. РНК-полимераза включает несколько нуклеотидов в цепь

Транскрипция

Элонгация транскрипции у бактерий

6. РНК-полимераза включает несколько первых нуклеотидов

7. РНК удаляется,
РНК-полимераза

Транскрипция

Элонгация транскрипции у бактерий

αII

αI

β

β’

ДНК

Смысловая цепь ДНК

Антисмысловая цепь ДНК

РНК

«Собачка» храпового
механизма

ДНК-связывающий
сайт

РНК-связывающий
сайт

«Мостик» храпового
механизма

Транскрипция

Работа храпового механизма

ДНК

«Собачка»

«Мостик»

РНК

Новый
нуклеотид

Смысловая нить

Антисмысловая
нить

Транскрипция

Элонгация транскрипции у эукариот

TATA

TFIIA

TFIID

TFIIB

Inr

+1

TATA

TFIIA

TFIID

TFIIB

Inr

+1

Шаг 6. С РНК-полимеразой связываются факторы элонгации (TFIIS

Транскрипция

Терминация транскрипции у бактерий

3’-NNNNNNNТАЦГГЦГТNNNNАЦГЦЦГТАААААААААNNNNNNN-5’
5’-NNNNNNNАТГЦЦГЦАNNNNТГЦГГЦАТТТТТТТТТNNNNNNN-3’

Терминирующий элемент

Палиндром

N – любой нуклеотид

5’-NNNNNNNАУГЦЦГЦАNNNNУГЦГГЦАУУУУУУУУУ -3’

Образование шпильки замедляет

Белок Rho связывается
со своим сайтом

Транскрипция

Терминация транскрипции у бактерий

Терминация с участием вспомогательных

Транскрипция

Терминация транскрипции у эукариот

Сигнал полиаденилирования

Зона терминации транскрипции (терминатор)

500-2000 н.

Поли-А хвост

Транскрипция

ДНК

+1

Транскрипт (РНК)

Транскрибируемая и кодирующая ДНК

Промотор

Терминатор

Транскрибируемая ДНК

Транскрипт

Нетранскрибируемая ДНК

Нетранскрибируемая ДНК

Белок

Транслируемая
РНК

Нетранслируемая
РНК

Нетранслируемая
РНК

Кодирующая ДНК

Трансляция

Экзон-интронная структура цистронов эукариот

Транскрибируемая ДНК

Кодирующая ДНК

Цистрон прокариот

Транскрибируемая ДНК

Кодирующая ДНК
(совокупность экзонов)

Цистрон эукариот

Экзон

Экзон-интронная структура цистронов эукариот

Экзон 1

Экзон 2

Экзон 3

Экзон 4

Интрон 1

Интрон 2

Интрон 3

Экзон

ПРОЦЕССИНГ мРНК

Процессинг мРНК

Кэпирование
Полиаденилирование
Сплайсинг

Этапы процессинга

Процессинг мРНК

Кэпирование

3’

5’

Незрелая мРНК

Процессинг мРНК - кэприрование

1. Гидролиз одной 5’-концевой фосфатной группы

2. Присоединение ГТФ (минус пирофосфат)

Процессинг мРНК - кэприрование

3. Метилирование по 7 атому гуанина

Процессинг мРНК - кэприрование

Кэп (m7G)

4. Метилирование нескольких нуклеотидов по 2’ атому рибозы

Кэп (m7G)

Процессинг мРНК

CEC

Кэпирование происходит непосредственно в процессе транскрипции
РНК-полимеразой II

Процессинг мРНК - кэприрование

TATA

TFIIA

TFIID

TFIIB

Inr

+1

CEC

TATA

TFIIA

TFIID

TFIIB

Inr

+1

CEC

Capping
Enzyme
Complex

(Комплекс

Процессинг мРНК - кэприрование

Функции кэпа

Транспорт из ядра в цитоплазму

мРНК кэпируется

С кэпом

Транскрипция

Терминация транскрипции у эукариот

Сигнал полиаденилирования

Зона терминации транскрипции (терминатор)

500-2000 н.

Поли-А хвост

Процессинг мРНК

Полиаденилирование

Сигнал полиаденилирования

ААУААА

ГУ-регион

Сайт
разрезания

Процессинг мРНК - полиаденилирование

Нуклеаза разрезает РНК у сайта полиаденилирования

ААУААА

ГУ-регион

Сайт
разрезания

CPSF

CstF

CPSF – эндонуклеаза

ААУААА

CPSF

PAP

PAP – полиаденилатполимераза

Процессинг мРНК - полиаденилирование

Полиаденилатполимераза строит поли-А-хвост

ААУААА

PAP

РНК-(А)n

РНК-(А)n+1

АТФ

PPi

PAP

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

~ 250xA

(безматричный синтез РНК)

Процессинг мРНК - полиаденилирование

Роль поли-А-хвоста

Защита от 3’-экзонуклеаз – стабилизация РНК

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

Белок

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

Белок

AAAAAAAAAAAAAAAAAA

Белок

Процессинг мРНК

Сплайсинг

Экзон 1

Экзон 2

Экзон 3

Экзон 4

Экзон 1

Экзон 2

Экзон 3

Экзон 4

Интрон 1

Интрон

Процессинг мРНК - сплайсинг

Переэтерификация точки ветвления и 5’-сайта интрона

Экзон 1

Экзон 2

А

ГУ

АГ

2’-OH

ГУ

ГУ

А

2’-OH группа рибозы

ГУ

А

Г

2’

У

О

P

О

-О

О

5’

«Лассо»

Процессинг мРНК - сплайсинг

Вытеснение лассо

Экзон 1

Экзон 2

А

Г

АГ

2’

У

О

P

О

-О

О

5’

OH

Экзон 1

Экзон 2

А

Г

АГ

2’

У

О

P

О

-О

О

5’

Процессинг мРНК - сплайсинг

Роль интронов и сплайсинга

Экзон 1

Экзон 2

Экзон 3

Экзон 4

Интрон

Процессинг мРНК

Зрелая мРНК

Экзон 1

Экзон 2

Экзон 3

Экзон 4

Интрон 1

Интрон 2

Интрон 3

Кэп

Поли-А-хвост

Экзоны

Трансляция

Транскрипция

Методы изучения

Нозерн-блоттинг

Саузерн-блоттинг (1975)

Электрофорез ДНК

Гель,
вид сбоку

Вымачивание в щелочи
для расхождения
цепей ДНК

Перенос (блотинг)
на фильтр

Фильтр,
вид

Транскрипция

Методы изучения

Нозерн-блоттинг

Саузерн-блоттинг

Фильтр,
вид сбоку

Денатурированная
ДНК на фильтре

Интересующий нас фрагмент ДНК

+
ДНК-полимераза I
+

α-[32P]-дАТФ

α-[32P]-дГТФ

α-[32P]-дЦТФ

α-[32P]-дТТФ

Задача:
определить, присутствует ли

Транскрипция

Методы изучения

Нозерн-блоттинг

Саузерн-блоттинг

Радиоактивно меченный
фрагмент ДНК,
интересующий нас

Денатурация

Гибридизация с денатурированными
образцами ДНК на фильтре

Фильтр

Авторадиография
на рентгеновской

Транскрипция

Методы изучения

Нозерн-блоттинг

«Southern» (Саузерн) – «южный»

«Northern» (нозерн) – «северный»

«Western» (вестерн) –

Транскрипция

Методы изучения

Нозерн-блоттинг

28S рРНК

18S рРНК

Зона, где находится
большинство мРНК

Блотинг

Гибридизация с фрагментом ДНК,
соответствующим интересующему

Транскрипция

Обратная транскриптаза
(ДНК-зависимая РНК-полимераза)

+ дезоксинуклеотиды

РНК

РНК

ДНК

+ праймер

РНК

Транскрипция

Методы изучения

ОТ-ПЦР

Раствор РНК

Праймер
5’-ТТТТТТТТТТТТТТТТТТТ-3’

Обратная транскриптаза
(ОТ)

Синтез ДНК

ПЦР

Задача: определить наличие в клетках РНК,
транскрибированной с

Транскрипция

Методы изучения

ОТ-ПЦР

ПЦР с праймерами, соответствующими интересующему нас гену

ДНК

1-й цикл

2-й цикл

Электрофорез

…..

Количество транскриптов