Причины ложноположительных результатов в ИФА

Август 9, 2022

Главная
Медицина
Причины ложноположительных результатов в ИФА

Содержание

2. Высокие чувствительность (до 99,5%) и специфичность (99,994%); Простота выполнения анализа; Относительно недорогой; Небольшие объемы исследуемого материала;
3. Причины ложноположительных результатов в ИФА Технические ошибки при проведении анализа: Преаналитический этап - подготовка пациента к
4. Преаналитический этап
5. Преаналитический этап Неустранимые факторы (возраст, состояние пациента: беременность, аутоимунные заболевания, иммунодефицит, опухоли и т.д.); Варьирующие факторы
6. Сравнительная характеристика гемоконсервантов
7. Влияние содержимого полимерных контейнеров на ОП анализируемого образца
8. Работа с контейнерами для сбора и хранения крови Попадание гемоконсервантов в пробоотборник для анализов приводит к
9. Цветовая маркировка вакуумных пробирок
10. Важно: цветовая маркировка пробирок, произведенных в США и ЕС может различаться!
11. Аналитический (лабораторный) этап
12. Точность скрининговых тестов на основе ИФА Анализ работы 752 лабораторий США показал, что чувствительность тестов на
13. Число образцов ОП крит ОП Нормальное распределение ОП при анализе сывороток на антитела к ВИЧ Повышается
14. Скрининг vs. подтверждение Набор 1 ОП крит. = 0,124 ОП крит. = 0,152 Набор 2
15. Биологические причины ложноположительных результатов в ИФА «Антигенная мимикрия» (антигены шистосомоза); Присутствие антител к другим ретровирусам; Высокое
16. Технические ошибки. Попадание перекиси в рабочий раствор конъюгата № 2 ОП крит. 1/40 капли Объём одной
17. Технические ошибки. Плёнка для заклеивания планшетов
18. Технические ошибки. Нарушение условий промывки планшетов
19. Технические ошибки. Нарушение условий промывки планшетов ОП крит.
20. Причины ложноотрицательных результатов Серонегативное «окно» - 10-14 дней от момента инфицирования; Серореверсия (поздние стадии, ВААРТ); «Атипичная
21. Специфические маркеры ВИЧ в динамике развития инфекционного процесса RNA HIV
22. Примеры ложноотрицательных результатов ИФА
23. Примеры ложноотрицательных результатов ИФА СПК, Приволжский ФО
24. Ложноотрицательные результаты. Сокращение продолжительности ферментативной стадии ОП крит.
25. Ложноотрицательные результаты. Способы внесения растворов в лунки планшета «Содержимое лунок тщательно перемешать осторожным постукиванием по краям
26. Ложноотрицательные результаты. Нарушение режима шейкирования ОП крит.
27. Ложноотрицательные результаты. Увеличение времени до внесения раствора хромогена в планшет после промывки
28. Ложноотрицательные результаты. Нарушение температуры инкубации с растворами конъюгатов ОП крит.
29. Постаналитический этап
30. Постаналитический этап Учет результатов: инструкция – расчет контрольных значений, критерии валидности теста; визуальный контроль – загрязнение
31. Ложноотрицательные результаты. Образцы с низким содержанием антигена р24
32. В заключение Появление ложных результатов при скрининге большого количества образцов сывороток неизбежно и обусловлено конструктивными особенностями
33. Алгоритм диагностики ВИЧ-инфекции (до внесения изменений) ИФА 1-скрининг Набор 1 ИФА 2,3 Набор 1 ИФА 3
34. Клинический осмотр, анамнез, диагноз (п.4.4.3) ИБ / ЛИА Исследование на ВИЧ-2 (п.4.4.5) – какими методами? ДНК/РНК
35. Диагностика ВИЧ-инфекции у детей, рожденных ВИЧ-инфицированными матерями (п.4.5.1.) ДНК/РНК ВИЧ 48 часов и 14-21 день после
36. Снятие с учета детей по перинатальному контакту по ВИЧ-инфекции Только в возрасте 6 мес. и старше
37. Изменения СП 3.1.5.2826-10 "Профилактика ВИЧ-инфекции" «Стандартным методом лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции служит одновременное определение антител к ВИЧ
38. Bell NM, Lever AM. HIV Gag polyprotein: processing and early viral particle assembly. Trends Microbiol. 2013;
39. Литература Bell NM, Lever AM. HIV Gag polyprotein: processing and early viral particle assembly. Trends Microbiol.
41. Скачать презентацию

Слайд 2

Высокие чувствительность (до 99,5%) и специфичность (99,994%);
Простота выполнения анализа;
Относительно недорогой;
Небольшие объемы

исследуемого материала;
Стабильность компонентов наборов при хранении (до года и более);
Возможность автоматизации всех этапов реакции.

Преимущества ИФА

Слайд 3

Причины ложноположительных результатов в ИФА
Технические ошибки при проведении анализа:
Преаналитический этап -

подготовка пациента к обследованию, взятие и обработка биологического материала;
Аналитический (лабораторный) этап;
Постаналитический этап – интерпретация и выдача результатов.
Биохимические (биологически опосредованные) причины:
Перекрестно реагирующие вещества в сыворотке крови.

Слайд 4

Преаналитический этап

Слайд 5

Преаналитический этап
Неустранимые факторы (возраст, состояние пациента: беременность, аутоимунные заболевания, иммунодефицит, опухоли

и т.д.);
Варьирующие факторы (диета, прием лекарств, вакцинации);
Время взятия крови (время приема пищи, лечебных и диагностических процедур);
Техника взятия крови (качество и количество пробы, использование различных пробирок/контейнеров для забора крови);
Ведение документации, идентификация человека и образца крови;
Применение специальных добавок (антикоагулянты, ингибиторы гликолиза, консерванты, сепарирующие гели);
Транспортировка и хранение проб;
Центрифугирование;
Браковка материала (гемолиз, хилез, фибриновые сгустки, липемия).
Ошибки на преаналитическом этапе
составляют 60% случаев и более! (Bonini, 2002)

Слайд 6

Сравнительная характеристика гемоконсервантов

Слайд 7

Влияние содержимого полимерных контейнеров на ОП анализируемого образца

Слайд 8

Работа с контейнерами для сбора и хранения крови
Попадание гемоконсервантов в пробоотборник

для анализов приводит к получению ложноположительных результатов!
Недостаточный объем крови приводит к изменению соотношения гемоконсервантов и крови, что также может служить причиной ложноположительных результатов.

Слайд 9

Цветовая маркировка вакуумных пробирок

Слайд 10

Важно: цветовая маркировка пробирок,
произведенных в США и ЕС может различаться!

Слайд 11

Аналитический (лабораторный) этап

Слайд 12

Точность скрининговых тестов на основе ИФА
Анализ работы 752 лабораторий США показал,

что чувствительность тестов на основе ИФА составила 99.7%, а специфичность - 98.5%. При исследовании крови доноров, специфичность ИФА достигала значения выше 99.99% .
В сочетании с методом Вестерн-блот, вероятность ложноположительного результата при исследовании донорских сывороток составляет 1 : 250 000 (Chou et al.,2005).

Слайд 13

Число образцов
ОП крит
ОП
Нормальное распределение ОП при анализе сывороток на антитела к

ВИЧ

Повышается чувствительность,
снижается специфичность

Повышается специфичность,
Снижается чувствительность

Слайд 14

Скрининг vs. подтверждение
Набор 1
ОП крит. = 0,124
ОП крит. = 0,152
Набор 2

Слайд 15

Биологические причины ложноположительных результатов в ИФА
«Антигенная мимикрия» (антигены шистосомоза);
Присутствие антител к

другим ретровирусам;
Высокое содержание липидов в сыворотке;
Гемолизированные сыворотки;
Аутоантитела (антитела ревматоидного фактора, аутоантитела против коллагена);
Антитела против углеводов;
Аутоиммунные заболевания, сопряженные с активацией поликлональных лимфоцитов;
Острые вирусные инфекции;
Вакцины против ВИЧ и гриппа;
Злокачественные опухоли;
Трансплантация органов;
Заболевания печени;
Беременность;
Иммунодефицитные состояния.

66 причин согласно Christine Johnson, 1996

Слайд 16

Технические ошибки. Попадание перекиси в рабочий раствор конъюгата № 2
ОП крит.
1/40

капли

Объём одной капли Н2О2 ≈ 40 мкл.
40 мкл 3% Н2О2 на 1 фл. раствора конъюгата (14 мл) = доля 3%-перекиси в растворе - 1:350.
14 000 : 350 = 40 . Достаточно 1/40 части капли 3% Н2О2 , чтобы получить неправильные результаты!!

1/4 капли

1/400 капли

Слайд 17

Технические ошибки. Плёнка для заклеивания планшетов

Слайд 18

Технические ошибки. Нарушение условий промывки планшетов

Слайд 19

Технические ошибки. Нарушение условий промывки планшетов
ОП крит.

Слайд 20

Причины ложноотрицательных результатов
Серонегативное «окно» - 10-14 дней от момента инфицирования;
Серореверсия (поздние

стадии, ВААРТ);
«Атипичная иммунная реакция»;
Агаммаглобулинемия (врожденный гуморальный иммунодефицит);
Инфекция штаммом редкой группы или ВИЧ-2;
Технические ошибки.

Слайд 21

Специфические маркеры ВИЧ в динамике развития инфекционного процесса
RNA HIV

Слайд 22

Примеры ложноотрицательных результатов ИФА

Слайд 23

Примеры ложноотрицательных результатов ИФА
СПК, Приволжский ФО

Слайд 24

Ложноотрицательные результаты. Сокращение продолжительности ферментативной стадии
ОП крит.

Слайд 25

Ложноотрицательные результаты. Способы внесения растворов в лунки планшета
«Содержимое лунок тщательно перемешать

осторожным постукиванием по краям планшета».

Слайд 26

Ложноотрицательные результаты. Нарушение режима шейкирования
ОП крит.

Слайд 27

Ложноотрицательные результаты. Увеличение времени до внесения раствора хромогена в планшет после

промывки

Слайд 28

Ложноотрицательные результаты. Нарушение температуры инкубации с растворами конъюгатов
ОП крит.

Слайд 29

Постаналитический этап

Слайд 30

Постаналитический этап
Учет результатов:
инструкция – расчет контрольных значений, критерии валидности теста;
визуальный

контроль – загрязнение дна лунки, дефекты пластика, посторонние включения в растворе, загрязнение линзы спектрофотометра;
паспорт – контрольные значения не должны значительно отличатся от указанных в паспорте.
Интерпретация данных:
строго по инструкции;
выделение «серых зон» ( прописаны в СОПах, ссылки на источник).
Канцелярские ошибки

Слайд 31

Ложноотрицательные результаты. Образцы с низким содержанием антигена р24

Слайд 32

В заключение
Появление ложных результатов при скрининге большого количества образцов сывороток неизбежно

и обусловлено конструктивными особенностями иммуноферментных тестов.
Соблюдение условий, описанных в инструкциях к тест-системам сокращает вероятность появления ложных результатов до минимума; позволяет потребителям реализовать заложенную производителями чувствительность и специфичность.
Интерпретация результатов ИФА должна осуществляться путём комплексной оценки данных, полученных на всех этапах проведения анализа.
Проведение мероприятий по контролю качества позволяет выявлять проблемы при проведении анализа и предотвращать появление ложных результатов.

Слайд 33

Алгоритм диагностики ВИЧ-инфекции (до внесения изменений)
ИФА 1-скрининг
Набор 1
ИФА 2,3
Набор 1
ИФА 3 референс
Набор

ИФА 4 референс
Набор 3

ИБ / ЛИА

Заключение об отсутствии антител к ВИЧ

Санитарно-эпидемиологические правила СП 3.1.5.2826-10 «Профилактика ВИЧ-инфекции». Утверждены 11.01.2011.
Изменения в СП 3.1.5.2826-10 от 21.07.2016

Заключение о наличии антител к ВИЧ

Дополнительные методы: определение р24 антигена, ПЦР (ДНК/РНК ВИЧ), в случае +результата - повторное обследование в ИБ / ЛИА через 2, 4, 6 недель
повторное исследование в ИБ (ЛИА) через 2 недели, 3, 6 месяцев

Слайд 34

Клинический осмотр,
анамнез, диагноз (п.4.4.3)
ИБ / ЛИА
Исследование на ВИЧ-2 (п.4.4.5) – какими

методами?

ДНК/РНК ВИЧ (п.4.4.6)

Клинический осмотр,
анамнез, диагноз,
забор крови для выявления РНК/ДНК ВИЧ (п 4.4.7.)

В ИБ выявлен Gag Р 24/25

или

ДНК/РНК ВИЧ

Повторное исследование методами ИБ, ИФА, ИХЛА на выявление Ат, Аг через 3 месяца (п.4.4.7)

ДНК/РНК ВИЧ?

Повторное исследование методами ИБ/ЛИА через 6 мес.
(через 12 мес. при АРТ) –п.4.4.8.

Повторное исследование через 2 недели (п.4.4.9) – какое?

Р 24/25 (п. 4.4.6)

Изменения в СП 3.1.5.2826-10 от 21.07.2016

Постановление Главного государственного санитарного врача РФ от 21.07.2016 N 95 "О внесении изменений в СП 3.1.5.2826-10 "Профилактика ВИЧ-инфекции" (Зарегистрировано в Минюсте России 20.10.2016 N 44101)

АТ к 2 из 3-х Env

Нет АТ

Ложноположительный, повторить обследование по назначению врача при необходимости (п.4.4.7.)

Слайд 35

Диагностика ВИЧ-инфекции у детей,
рожденных ВИЧ-инфицированными матерями (п.4.5.1.)
ДНК/РНК ВИЧ
48 часов и

14-21 день после рождения

Применяется АРТ

ДНК/РНК ВИЧ
I исследование -2 недели после окончания курса АРТ

ДНК/РНК ВИЧ
II исследование –в возрасте 4-6 месяцев

ДНК/РНК ВИЧ
II исследование – в кратчайшие сроки

Отсутствие ВИЧ-инфекции, снятие с учета возрасте старше 6 мес.

Подтверждение диагноза ВИЧ-инфекция

Подтверждение диагноза «ВИЧ-инфекция»

Возможно, здоров

Слайд 36

Снятие с учета детей по перинатальному контакту по ВИЧ-инфекции
Только в возрасте

6 мес. и старше врачебной комиссией при условиях (п. 4.5.2.):
≥ 2 ИФА (-) – в каком возрасте?
Отсутствие гипогаммаглобулинемии;
≥ 2 ПЦР (-) ДНК или РНК ВИЧ в возрасте 1,5-2 мес. и старше и 4 мес.;
Отсутствие грудного вскармливания.
Отсутствие клинических проявлений ВИЧ-инфекции;
Ребенок получал грудное вскармливание от ВИЧ-инфицированной матери (п. 4.5.3.):
Прекращение грудного вскармливания;
Обследование ПЦР ДНК или РНК ВИЧ через 4-6 недель, 3 мес. И 6 мес. после прекращения грудного вскармливания;
При достижении возраста 18 месяцев диагностика детей, рождённых ВИЧ-инфицированными матерями, осуществляется так же, как у взрослых (п. 4.5.4).

Слайд 37

Изменения СП 3.1.5.2826-10 "Профилактика ВИЧ-инфекции"
«Стандартным методом лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции служит одновременное

определение антител к ВИЧ 1,2 и антигена р 24/25 ВИЧ с помощью диагностических тестов ИФА и ИХЛА»(п. 4.3.).
Подтверждение результатов скрининга – «используемые вторая и третья тест-системы должны иметь аналогичные и более высокие аналитические характеристики (чувствительность, специфичность) по сравнению с скрининговой тест-системой» (п.4.4.2).
Исправлена ошибка в п. 4.4.3 о критериях положительных результатов блота.
«Исключить проведение повторных обследований методом ИБ у лиц с установленным ранее диагнозом «ВИЧ-инфекция» (п.4.4.10.).
«Принять меры по обеспечению сохранности сывороток ВИЧ-инфицированных в течение не менее 1 года с момента постановки диагноза» (п.4.4.11.).
«Пожизненное отстранение ВИЧ-инфицированных и позитивных в ИФА при референс-исследовании от сдачи крови, плазмы, органов и тканей. Допускается отмена отстранения от донорства при динамическом наблюдении в случае, если в течение 12 месяцев от донора были получены отрицательные результаты обследования на ВИЧ в ИФА, не были обнаружены ДНК, РНК ВИЧ, отсутствовали факторы заражения ВИЧ» (п.8.1.2.3).

Слайд 38

Bell NM, Lever AM. HIV Gag polyprotein: processing and early viral

particle assembly. Trends Microbiol. 2013; 21(3):136-44.

Gag р 25 – что это?

Слайд 39

Литература
Bell NM, Lever AM. HIV Gag polyprotein: processing and early viral

particle assembly. Trends Microbiol. 2013; 21(3):136-44.
Bonini PA, Plebani M, Ceriotti F, Rubboli F. Errors in laboratory medicine. Clin Chem. 2002;48:691–8.
Chou R, Huffman LH, Fu R, Smits AK, Korthuis PT (July 2005). "Screening for HIV: a review of the evidence for the U.S. Preventive Services Task Force". Ann. Intern. Med. 143 (1): 55–73.
Johnson C. Whose Antibodies Are They Anyway? Continuum (London) September/October 1996; 4(3):4-5.
Постановление Главного государственного санитарного врача РФ от 21.07.2016 N 95 "О внесении изменений в СП 3.1.5.2826-10 "Профилактика ВИЧ-инфекции"
Санитарно-эпидемиологические правила СП 3.1.5.2826-10 «Профилактика ВИЧ-инфекции».
Шарипова И.Н., Ходак Н.М., Пузырев В.Ф., Бурков А.Н., Уланова Т.И. Сравнительное исследование специфичности тест-систем для диагностики ВИЧ-инфекции на категории образцов сывороток крови беременных женщин / Клиническая лабораторная диагностика №3, 2015. – с. 38 -41.

Причины ложноположительных результатов в ИФА

Содержание

Высокие чувствительность (до 99,5%) и специфичность (99,994%);Простота выполнения анализа;Относительно недорогой;Небольшие объемы

Причины ложноположительных результатов в ИФАТехнические ошибки при проведении анализа:Преаналитический этап -

Преаналитический этап

Преаналитический этапНеустранимые факторы (возраст, состояние пациента: беременность, аутоимунные заболевания, иммунодефицит, опухоли

Сравнительная характеристика гемоконсервантов

Влияние содержимого полимерных контейнеров на ОП анализируемого образца

Работа с контейнерами для сбора и хранения кровиПопадание гемоконсервантов в пробоотборник

Цветовая маркировка вакуумных пробирок

Важно: цветовая маркировка пробирок, произведенных в США и ЕС может различаться!

Аналитический (лабораторный) этап

Точность скрининговых тестов на основе ИФААнализ работы 752 лабораторий США показал,

Число образцовОП критОПНормальное распределение ОП при анализе сывороток на антитела к

Скрининг vs. подтверждениеНабор 1ОП крит. = 0,124ОП крит. = 0,152Набор 2

Биологические причины ложноположительных результатов в ИФА«Антигенная мимикрия» (антигены шистосомоза);Присутствие антител к

Технические ошибки. Попадание перекиси в рабочий раствор конъюгата № 2ОП крит.1/40

Технические ошибки. Плёнка для заклеивания планшетов

Технические ошибки. Нарушение условий промывки планшетов

Технические ошибки. Нарушение условий промывки планшетовОП крит.

Причины ложноотрицательных результатовСеронегативное «окно» - 10-14 дней от момента инфицирования;Серореверсия (поздние

Специфические маркеры ВИЧ в динамике развития инфекционного процессаRNA HIV

Примеры ложноотрицательных результатов ИФА

Примеры ложноотрицательных результатов ИФАСПК, Приволжский ФО

Ложноотрицательные результаты. Сокращение продолжительности ферментативной стадииОП крит.

Ложноотрицательные результаты. Способы внесения растворов в лунки планшета«Содержимое лунок тщательно перемешать

Ложноотрицательные результаты. Нарушение режима шейкированияОП крит.