Выделение ДНК. (Практикум 1)

Август 19, 2022

Главная
Медицина
Выделение ДНК. (Практикум 1)

Содержание

2. Литература Кутлунина Н.А., Ермошин А.А. Молекулярно-генетические методы в исследовании растений : учеб.-метод. пособие. М-во образования и
3. Работа с реактивами Обращайте внимание на маркировку. Используйте только подписанные реактивы. При необходимости отмечайте дату вскрытия
4. Взвешивание Если при взвешивании реактив (объект) попал на весы: НЕ НАДО ЕГО СДУВАТЬ! Следует аккуратно снять
5. Автоматическая пипетка Внимательно работайте с горячими, холодными, вязкими растворами и растворами с небольшим поверхностным натяжением. Отбор
6. Автоматическая пипетка Правила работы: Отжать пипетку до первого упора; Отбирать жидкость с поверхности, наконечник глубоко не
10. Ламинар-бокс Лабораторный прибор для работы с биологическими объектами в стерильных условиях. Шкаф, оборудованный осветителями, ультрафиолетовыми лампами
11. Зачем выделять НК? Выделение ДНК и РНК — важный шаг подготовки проб перед биохимическими и диагностическими
12. ПЦР ПЦР (полимеразная цепная реакция) представляет собой реакцию синтеза комплементарной цепочки ДНК на ДНК матрице, катализируемую
13. Ингибиторы ПЦР Изменяют конформацию фермента, уменьшают его активность.
14. Способы выделения НК осаждение НК на суспензионный носитель; выделение на колонках. Традиционные методы выделения являются надежными
15. Способы выделение НК https://vmtbio.ru/isolation-dna/ Фенол-хлороформная экстракция (Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chloroform Extraction). FTA-карты. С помощью коммерческих наборов (KITs) Силикатные
16. Растительный материал для выделения ДНК Выделять ДНК можно из свежих или замороженных (при минус 70–80 °С)
17. Особенности выделения ДНК из растительных объектов При выделении ДНК из растительных объектов необходимо дезактивировать клеточные ферменты,
18. Особенности выделения ДНК из растительных объектов В целом выделение ДНК включает обязательные процедуры: – разрушение клеток
19. После экстракции целесообразно проверить качество выделенной НК, например, измерить концентрацию с помощью флюориметра/спектрофотометра, провести гель-электрофорез или
20. Список оборудования для выделения ДНК Растительная ткань (замороженная жидким азотом, свежая или высушенная) Набор реагентов Центрифуга
22. 1 мл = 1000 мкл на 100 проб
23. 1. Внесение образца
24. Около 10 мг сухого образца
26. 2. Лизис клеток
27. Не забыть: Перчатки одеть Добавить реагент Сбросить наконечник («тип») Закрыть пробирки, баночки с реактивами
28. Удаление РНК
29. Трясем через каждые 20 мин
30. 3. Осаждение белков
32. 4. Осаждение ДНК
36. 5. Промывка и растворение ДНК
39. Скачать презентацию

Слайд 2

Литература
Кутлунина Н.А., Ермошин А.А. Молекулярно-генетические методы в исследовании растений : учеб.-метод.

пособие. М-во образования и науки Рос. Федерации, Урал. федер. ун-т. – Екатеринбург : Изд-во Урал. ун-та, 2017. – 142 с.
Методы выделения ДНК из биологического материала https://vmtbio.ru/isolation-dna/

Слайд 3

Работа с реактивами
Обращайте внимание на маркировку.
Используйте только подписанные реактивы.
При необходимости отмечайте

дату вскрытия емкости с реактивом для учета длительности хранения.
На банке с реактивом указывают:
Название и молекулярная формула;
Каталожный номер и название фирмы;
Номер партии;
Дата, до которой продукт годен к употреблению;
Условия хранения.

Слайд 4

Взвешивание
Если при взвешивании реактив (объект) попал на весы: НЕ НАДО

ЕГО СДУВАТЬ!
Следует
аккуратно снять чашку (и, если надо, верхний кожух весов);
вымыть кожух и насухо его протереть;
весы протереть влажной тряпкой/салфеткой, насухо вытереть;
всё собрать.

Слайд 5

Автоматическая пипетка
Внимательно работайте с горячими, холодными, вязкими растворами и растворами с

небольшим поверхностным натяжением.
Отбор неправильного объёма жидкости (некачественный наконечник, не сразу коснулся жидкости, закупорился). Следует контролировать работу пипетки "на глаз".
Обращайте внимание, чтобы наконечник не касался ничего лишнего своей внешней поверхностью.

Слайд 6

Автоматическая пипетка
Правила работы:
Отжать пипетку до первого упора;
Отбирать жидкость

с поверхности, наконечник глубоко не опускать;
Выдавливать жидкость, отжав пипетку до второго упора (по возможности на стенку пробирки или на поверхность жидкости).
Для того чтобы жидкость не попала внутрь автоматической пипетки:
Плавно отпускать поршень вверх;
Не класть на стол пипетку с надетым наконечником;
Не сбрасывать наконечник с жидкостью.

Слайд 7

Слайд 8

Слайд 9

Слайд 10

Ламинар-бокс
Лабораторный прибор для работы с биологическими объектами в стерильных условиях.

Шкаф, оборудованный осветителями, ультрафиолетовыми лампами и системой подачи стерильного воздуха.
Используется в микробиологических, молекулярно-биологических работах, работах с культурой клеток, тканей и органов.
Стерильный воздух подаётся в бокс ламинарным потоком (равномерное движение воздуха без завихрений).

Слайд 11

Зачем выделять НК?
Выделение ДНК и РНК — важный шаг подготовки

проб перед биохимическими и диагностическими процессами.
Амплификация, проведение обратной транскрипции, детектирование накопления продуктов амплификации методом ПЦР в реальном времени, клонирование, синтез ДНК и др. процедуры, выполняют на биологических образцах с предварительно выделенными и очищенными нуклеиновыми кислотами (НК).

Слайд 12

ПЦР
ПЦР (полимеразная цепная реакция) представляет собой реакцию синтеза комплементарной цепочки ДНК

на ДНК матрице, катализируемую ферментом ДНК-зависимой ДНК-полимеразой.
Фермент термостабильный – он может выдерживать высокие температуры, необходимые на этапе денатурации. Оптимум работы полимеразы составляет около 72°C. Для создания оптимальных условий синтеза образец ДНК помещается в так называемую реакционную смесь .

Американский биохимик Кэрри Муллис – нобелевский лауреат 1993 г. в области химии (совместно с
Майклом Смитом) за изобретение ПЦР

Слайд 13

Ингибиторы ПЦР
Изменяют конформацию фермента, уменьшают его активность.

Слайд 14

Способы выделения НК
осаждение НК на суспензионный носитель;
выделение на колонках.
Традиционные

методы выделения являются надежными и прошли испытание временем, но сейчас на рынке имеется широкий ассортимент товаров, включая полные наборы, содержащие большинство реагентов, необходимых для выделения нуклеиновых кислот.
Большинство из них все же требует многократных этапов центрифугирования, которые сопровождаются удалением супернатанта. В последний годы повысился спрос на автоматические системы (выход НК и чистота материала, воспроизводимость и прогностичность эксперимента - максимальные, а риск контаминации (заражения) снижается.

Супернатант - фаза дисперсионной системы, которая располагается сверху от границы раздела фаз.

Слайд 15

Способы выделение НК https://vmtbio.ru/isolation-dna/
Фенол-хлороформная экстракция (Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chloroform Extraction).
FTA-карты.
С помощью коммерческих наборов (KITs)
Силикатные

носители (Силика, Silica Matrices).
Стеклянные носители (Glass Particle).
Диатомит.
Очистка нуклеиновых кислот с использованием магнитных микроносителей (Magnetic Bead Based Nucleic Acid Purification).
Анионообменные смолы.

Слайд 16

Растительный материал для выделения ДНК
Выделять ДНК можно из свежих или замороженных

(при минус 70–80 °С) растительных образцов, из частей растений, высушенных в силикагеле, или из гербарных образцов.
Для выделения ДНК обычно используют листья растений.
При выборе частей растения для выделения ДНК нужно выбирать участки, не пораженные грибковыми и другими заболеваниями, чтобы избежать загрязнения проб чужеродной ДНК.

Слайд 17

Особенности выделения ДНК из растительных объектов
При выделении ДНК из растительных объектов необходимо

дезактивировать клеточные ферменты, «удалить» запасные вещества (полисахариды), вторичные метаболиты: алкалоиды, фенольные соединения, терпены, которые мешают выделению ДНК и отрицательно влияют на её качество
В связи с многообразием метаболитов у представителей различных таксонов, а иногда и представителей одного рода растений, единого оптимального протокола изолирования ДНК не существует.

Слайд 18

Особенности выделения ДНК из растительных объектов
В целом выделение ДНК включает обязательные процедуры:
–

разрушение клеток или лизис;
– удаление мембранных липидов;
– удаление вторичных метаболитов и запасных веществ;
– удаление белков;
– удаление РНК;
– осаждение ДНК;
– растворение ДНК (хранение).

Слайд 19

После экстракции целесообразно проверить качество выделенной НК, например, измерить концентрацию с

помощью флюориметра/спектрофотометра, провести гель-электрофорез или ПЦР со специальными праймерами – факторами элонгации.

Флуориметр Qubit 2

Слайд 20

Список оборудования для выделения ДНК
Растительная ткань (замороженная жидким азотом, свежая или

высушенная)
Набор реагентов
Центрифуга для микропробирок
Вортекс (встряхиватель)
Микропипетки (20, 200, 1000 мкл) и наконечники к ним
Штатив для пробирок объемом 1.5 или 2.0 мл
Микропробирки объемом 1.5 или 2.0 мл
Термостат
Перчатки одноразовые медицинские

Слайд 21

Слайд 22

1 мл = 1000 мкл
на 100 проб

Слайд 23

1. Внесение образца

Слайд 24

Около 10 мг сухого образца

Слайд 25

Слайд 26

2. Лизис клеток

Слайд 27

Не забыть: Перчатки одеть Добавить реагент Сбросить наконечник («тип») Закрыть пробирки, баночки с реактивами

Слайд 28

Удаление РНК

Слайд 29

Трясем через каждые 20 мин

Слайд 30

3. Осаждение белков

Слайд 31

Слайд 32

4. Осаждение ДНК

Слайд 33

Слайд 34

Слайд 35

Слайд 36

5. Промывка и растворение ДНК

Слайд 37

Выделение ДНК. (Практикум 1)

Содержание

ЛитератураКутлунина Н.А., Ермошин А.А. Молекулярно-генетические методы в исследовании растений : учеб.-метод.

Работа с реактивамиОбращайте внимание на маркировку.Используйте только подписанные реактивы.При необходимости отмечайте

Взвешивание Если при взвешивании реактив (объект) попал на весы: НЕ НАДО

Автоматическая пипеткаВнимательно работайте с горячими, холодными, вязкими растворами и растворами с

Автоматическая пипеткаПравила работы: Отжать пипетку до первого упора; Отбирать жидкость

Ламинар-бокс Лабораторный прибор для работы с биологическими объектами в стерильных условиях.

Зачем выделять НК? Выделение ДНК и РНК — важный шаг подготовки

ПЦР ПЦР (полимеразная цепная реакция) представляет собой реакцию синтеза комплементарной цепочки ДНК

Ингибиторы ПЦРИзменяют конформацию фермента, уменьшают его активность.

Способы выделения НКосаждение НК на суспензионный носитель;выделение на колонках. Традиционные

Способы выделение НК https://vmtbio.ru/isolation-dna/Фенол-хлороформная экстракция (Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chloroform Extraction).FTA-карты.С помощью коммерческих наборов (KITs)Силикатные

Растительный материал для выделения ДНКВыделять ДНК можно из свежих или замороженных

Особенности выделения ДНК из растительных объектовПри выделении ДНК из растительных объектов необходимо

Особенности выделения ДНК из растительных объектовВ целом выделение ДНК включает обязательные процедуры:–